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卵巢癌临床治疗棘手,亟需探索新的治疗手段与策略。靶向 CD19的嵌合抗原受体修饰T细胞(Chimeric Antigen Receptor-modified T cells,CART),在治疗急性B淋巴细胞肿瘤中取得了令人鼓舞的临床效果,也为卵巢癌治疗带来新的契机。然而,与血液系统肿瘤相比,CART治疗卵巢癌等实体瘤的疗效并不明确,相关临床研究尚待开展。 选择合适的肿瘤相关抗原(Tumor Associate antigen,TAA)、避免鼠源性单链抗体(single-chain variable fragment,ScFv)造成的宿主抗异基因体液免疫应答、体外快速扩增治疗数量级的CART细胞,是CART治疗成功的重要前提。本研究采用基于人源化抗间皮素(mesothelin,MSLN)ScFv的CAR融合基因,成功制备表达该融合基因的CART细胞并扩增至临床治疗要求的数量级;体外实验证明,抗MSLN CART细胞能够特异性识别和杀伤MSLN阳性的卵巢癌细胞;免疫缺陷小鼠原位移植瘤模型证明,抗MSLN CART细胞能够显著地抑制肿瘤生长,延长荷瘤小鼠的生存时间,并在小鼠体内长期续存。为进一步的临床研究奠定了基础。 结果与结论: 1.MSLN是卵巢癌CART治疗较理想的靶点。 GEO数据库分析结果显示:与正常组织相比,3个卵巢癌常用的 TAA靶点中,MSLN在癌组织中上调表达差异性最显著(P=0.0003);采用免疫组化检测卵巢癌组织样本中 MSLN表达水平并进行定量分析,结果显示:正常组织不/低表达MSLN(17.05±30.74,n=125),卵巢癌组织高表达(449.14±1066.53,n=24),差异显著(P=0.0002);MSLN主要表达于卵巢癌实质细胞的细胞膜(351.64±870.72),阳性率为77..36±36.67%;此外,我们确定卵巢癌细胞株SNU-119高表达MSLN,而H08910不表达MSLN,差异显著(P<0.0001),可用于后续杀伤效应评估。表明:MSLN是CART治疗卵巢癌较理想的靶向抗原。 2.成功制备人源化ScFv抗MSLN-CART细胞。 将人源化抗MSLN ScFv片段、CD3ζ链和T细胞活化共刺激分子CD28编码序列组成融合基因,克隆于慢病毒载体 PWPXLD-GFP中,包装慢病毒感染激活的外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC),获取CD3+GFP+细胞,阳性率(51.64±12.93)%,与空载体对照组相比,RT-PCR检测到抗 MSLN-CART细胞组 CAR融合基因mRNA表达(P=0.0016),Western-blot检测到CAR融合蛋白的表达。表明:成功制备抗MSLN-CART细胞。 3.成功体外快速扩增抗MSLN-CART细胞至治疗数量级。 3-4周内将制备的 CART在体外扩增至临床治疗所需要的数量级,是成功实施CART治疗的前提之一。我们在 GMP条件下改进“快速扩增程序”,3周内将4×105个CART细胞稳定扩增至(9.4±0.316)×109个(扩增2-2.3万倍)。表明:采用的CART细胞体外扩增体系和方法能够获得满足后续临床实验需求的CART细胞。 4.抗MSLN-CART细胞显著抑制卵巢癌生长。 体外杀伤实验结果表明,MSLN-CART具有靶向杀伤 MSLN阳性卵巢癌细胞(SNU-119)的能力,在效靶比(E∶T)=2-4∶1时,CART细胞组对SNU-119细胞的杀伤率达到80%;NOD/SCID小鼠卵巢原位移植瘤体外杀伤实验结果表明,回输两次CART细胞(5×108/kg)后肿瘤完全消失,杀伤率100%;回输15天后,小鼠体内仍能检测到CART细胞,小鼠生存状态良好,未见明显副作用出现。表明:该抗MSLN-CART细胞治疗卵巢癌具有较高的安全性和有效性,且能在体内长期续存。