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目的:探讨纳米脂肪联合鼠神经生长因子对游离股前外侧穿支皮瓣术后感觉恢复的影响及潜在治疗机制,为促进皮瓣术后感觉恢复提供安全、有效的临床治疗方案及理论基础。方法:一.临床研究1.患者招募:制定纳入、排除标准,招募已行游离股前外侧穿支皮瓣术术后4月的患者16人;2.术前皮瓣感觉评估及取材:术前评估皮瓣及周围区域痛觉、温度觉、两点辨别觉、触压觉,使用直径为5mm打孔器获取皮瓣皮肤组织。3.纳米脂肪与鼠神经生长因子混合物的制备:参考Tonnard的方法获取纳米脂肪,将鼠神经生长溶液与纳米脂肪以1:9比例混合。4.实验的干预:鼠神经生长因子注射组(N组)、纳米脂肪注射组(Na组)、鼠神经生长因子联合纳米脂肪组(NN组)、生理盐水组(NS组)。5.术后评估:按术前方法进行皮瓣感觉评估,在术前取皮部位再次使用打孔器取材。免疫组化:通过CD31免疫组织化学染色观察皮瓣皮肤新生血管情况,通过S100免疫组织化学染色观察皮瓣皮肤神经再生情况,选取5个视野后Image J软件分别手动计数新生血管数目、阳性细胞表达的个数,将感觉评估、免疫组化术前术后数据求差值,统计结果。二.基础研究6.使用临床制备的纳米脂肪,用II型胶原酶消化法提取人脂肪来源干细胞(h ADSCs),传至第3代用于本实验。7.运用流式细胞仪检测h ADSCs表面标志物CD90、CD105、CD73、CD34、CD11b、CD19、CD45及HLADR的表达情况。用三系诱导试剂分别诱导细胞,再用油红、阿利辛蓝、茜素红染色鉴定结果。8.细胞增殖实验:研究不同浓度鼠神经生长因子(0.9μg/m L、0.09μg/m L、0.009μg/m L)对体外培养的h ADSCs增殖的影响;简述之:将3代h ADSCs消化、重悬、计数。分组:实验组、阴性对照组、空白对照组。种板:将计数好的h ADSCs接种至96孔板,置于培养箱中培养。加药:加入含不同浓度的鼠神经生长因子浓度的培养基,继续培养。加CCK-8试剂:分别于培养24h、48h,加入含10%CCK-8试剂的无血清培养基,继续培养2h,用酶标仪检测h ADSCs 450nm处的光密度值(OD值)。9.酶联免疫吸附剂测定:研究鼠神经生长因子对体外培养的脂肪来源干细胞旁分泌的影响。简述之:收集上清液,参照ELISA试剂盒说明,加入相应标准品,然后加入酶结合物(空白对照孔除外),再加入抗体,混匀,封片,置37℃温育1小时。弃去液体,洗涤,甩干。加入显色剂A、B液,37℃避光显色,加终止液。用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD)值。计算出样品浓度。三.统计学分析实验结果表示采用均数±标准差(±s)的方式,运用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析。计量资料数据经正态性检验后,组间多重比较方差齐性时采用LSD法检验,方差不齐时采用Dunnett’s T3法检验;P值<0.05为有统计学意义。结果:1.注射纳米脂肪和或鼠神经生长因子术前术后患者皮瓣温度觉、两点辨别觉、触压觉数据差值较生理盐水组大,联合组差值最大,分别为6例、18.73±2.72mm、1.24±0.26(规格).2.免疫组化结果显示注射纳米脂肪和或鼠神经生长因子术前术后皮瓣皮肤CD31、S100表达量差值较生理盐水组大,联合组差值最大,分别为22.00±2.58、11.81±4.63。3.从人纳米脂肪(nanofat)中提取h ADSCs,P0细胞存在许多杂质,培养48小时后大部分细胞粘附于培养瓶底,呈梭形和多边形。P3代细胞中杂质很少,具有规则的细胞形态,呈长梭形,细胞间相互交联。4.流式细胞仪检测h ADSCs表面大量表达CD73、CD90、CD105,几乎不表达CD45、CD34、CD11b、CD19、HLADR。经三系诱导分化后,h ADSCs显示具有成脂、成骨、成软骨的能力。5.细胞增殖实验显示加入浓度为0.9μg/m L鼠神经生长因子于h ADSCs后24h、48h,测得的光密度值(OD值)分别是对照组的1.17±0.03倍、1.28±0.07倍。酶联免疫吸附剂测定显示将浓度为0.9μg/m L鼠神经生长因子与h ADSCs共培养后,h ADSCs分泌的神经营养因子(NGF、NT-3)的量分别是对照组的4.40±0.44倍、1.76±0.17倍。结论:1.鼠神经生长因子联合纳米脂肪移植可促进游离股前外侧皮瓣术后感觉恢复,机制可能与增加的血管新生和神经再生有关。2.鼠神经生长因子可促进体外培养的h ADSCs增殖和旁分泌多种神经营养因子。