目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)最常见而严重的并发症,是终末期肾病的主要原因之一。糖尿病肾病的病变特征为肾小球系膜基质积聚和基底膜增厚。细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的成分与含量取决于基质合成与降解两者之间的动态平衡。近年来的研究显示ECM降解能力下降在DN的发生、发展中起着重要的作用。基质金属蛋白酶(metalloproteinases,MMPs)是负责ECM降解的主要酶系,其中MMP-2(又称明胶酶A)主要参与IV型胶原的降解,而后者是DN中肾小球基底膜增厚和系膜基质堆积的主要成分,因此与DN的关系最为密切。关于MMP-2及其组织抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinase-2, TIMP-2)在DN中的作用存有较多争议,而且关于MMP-2酶原的特异膜型激活因子—膜型基质金属蛋白酶-1(membrane type 1-matrix metalloproteinase,MT1-MMP)在DN中的表达及作用鲜见研究。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor ,CTGF)是转化生长因子(transforming growth factor-β1, TGF-β1)下游重要效应分子,因其较强的致纤维化作用,且生物效应较单一成为DN研究的热点。目前有关CTGF在糖尿病肾病ECM代谢障碍中的作用机制鲜有深入研究报道。肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)的激活,血管紧张素Ⅱ(angiotensin II,AngII)的增加是DN发病机制中的关键环节,抑制AngII的产生并干扰其作用是DN治疗的关键。厄贝沙坦是血管紧张素Ⅱ1型受体拮抗剂(angiotensin II receptor I antagonist, AT1Ra),其肾脏保护作用是否涉及细胞外基质代谢紊乱尚未见报道。TGF-β1诱导ECM代谢失衡在组织纤维化进程中具有关键作用。TGF-β1的各种生物效应是依靠其信号转导网络来实现的,其中最重要的是Smads(Sma and Mad protein)蛋白转导途径。由于Smad2及Smad3具有较高同源性,在以往的研究中很难区分。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是近年发展起来的一种新型基因静默技术,该技术具有高度的序列专一性,能简单、高效地阻抑特定基因的表达。本研究以糖尿病大鼠模型和体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell, GMCs)为对象,从整体、细胞和分子水平,系统观察CTGF、MMP-2、TIMP-2和MT1-MMP表达的变化,并通过RNAi分别敲低系膜细胞Smad2和Smad3蛋白表达,以探讨TGF-β1/Smad信号通路在糖尿病性ECM代谢失衡中的作用。通过厄贝沙坦对动物及细胞的干预实验探讨AT1Ra对肾脏保护作用的机制。方法:1.糖尿病动物模型制备及相关指标观察雄性Wistar大鼠42只,戊巴比妥钠腹腔麻醉(40mg/kg)后行右肾切除术。2周后将大鼠随机分为三组:右肾切除对照组(n=18),糖尿病组(DM, n=18)和厄贝沙坦干预组(DM+Irb, n=6)。其中DM组和厄贝沙坦干预组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ,65 mg/kg溶于0.1mol/L枸椽酸缓冲液中,pH值4.5),对照组只注射相同体积的枸橼酸缓冲液,48h后尾尖取血,血糖仪测定血糖,尿糖试纸测定尿糖,血糖≥16.7mmol/L,尿糖+++~++++者确定为糖尿病模型。厄贝沙坦干预组给予厄贝沙坦50mg·kg-1·d-1灌胃,连续给药12周。对照组和DM组只用等量生理盐水灌胃。厄贝沙坦干预组大鼠于给药12周后,对照组和DM组分别于注射STZ后4、8和12周每组取6只大鼠,收集血尿标本,切取肾脏,光镜观察肾脏一般病理改变,免疫组化检测肾组织MMP-2、TIMP-2和CTGF蛋白表达,以Western blot和RT-PCR分别检测肾组织MMP-2、TIMP-2、MT1-MMP和CTGF的蛋白和mRNA的表达。2.大鼠肾小球系膜细胞的培养和相关指标观察用含10%胎牛血清及100KU/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养基培养大鼠肾小球系膜细胞。细胞分为低糖组(LG组:5.5 mmol/L葡萄糖),渗透压对照组(LG+M组:5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇),高糖组(HG组:30 mmol/L葡萄糖)和厄贝沙坦组处理组(HG+Irb组)。LG组、LG+M组和HG组分别刺激24h、48h、72h、96h。HG+Irb组设3个浓度,分别为:10-4mol/L,10-5mol/L,10-6mol/L,刺激时间为48h;然后选择浓度10-5mol/L,刺激24h、48h、72h、96h。于实验终点用免疫细胞化学、免疫荧光细胞化学、Western blot和RT-PCR检测MMP-2、TIMP-2、MT1-MMP和CTGF蛋白和mRNA的表达,并用ELISA法检测细胞上清中IV型胶原的含量。3. RNA干扰及相关指标观察针对大鼠Smad2和Smad3编码序列分别设计3条体外转录的小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)。优化转染条件后将siRNA分别转染入系膜细胞,同时设正常和阴性对照,于转染结束后48小时收集细胞,提取蛋白,分别检测Smad2、Smad3和Smad4的蛋白表达量,确定敲低效果最佳的siRNA,并确认Smad2与Smad3的siRNA对相互间靶基因无交叉抑制,同时对Smad4也无抑制。随后将对数生长期细胞接种于6孔培养板中,24h后待细胞融合50%-60%开始转染。将细胞分为空白细胞对照孔、TGF-β1刺激孔、阴性对照+TGF-β1孔(转染阴性对照siRNA)、Smad21+TGF-β1孔(转染Smad21 siRNA)、Smad33+TGF-β1孔(转染Smad33 siRNA)、Smad21+Smad33+TGF-β1孔(转染Smad21和Smad33 siRNA)。转染后除空白对照组外,其余各组均经2ng/ml TGF-β1刺激48h后收集细胞提取蛋白和RNA,用Western blot和RT-PCR分别检测各组MMP-2、TIMP-2、MT1-MMP和CTGF的蛋白和mRNA表达。结果:1. MMP-2、TIMP-2、MT1-MMP和CTGF在糖尿病大鼠肾脏的表达①光镜下观察,糖尿病组大鼠从4周开始肾小球体积增大,8、12周系膜细胞增生,基质轻度增多,肾小管上皮细胞出现空泡变性,小灶状萎缩,间质水肿、炎症细胞浸润及间质纤维沉积。厄贝沙坦干预组大鼠肾组织病变较糖尿病组减轻。②免疫组化结果显示:与对照组相比,糖尿病组从4周开始MMP-2在肾小球的表达明显减少,而在肾小管则未有明显变化, 8周和12周糖尿病组肾小球和肾小管MMP-2表达均持续减少。TIMP-2和CTGF在对照组的肾小球及间质中仅有少量的表达,而糖尿病组从4周至12周二者表达逐渐增强。与糖尿病组相比,厄贝沙坦干预组肾组织MMP-2表达升高,而TIMP-2和CTGF的表达则明显降低。③Western blot和半定量RT-PCR结果:与对照组相比,糖尿病组MMP-2和MT1-MMP表达从第4周开始下降,到第8周和12周显著下降,其中酶原型MMP-2(72kD )与活化型的MMP-2(63kD)的变化趋势基本一致;CTGF和TIMP-2则与之相反,从4周开始即表达明显增强,且表达水平随时间持续增高。糖尿病组CTGF的表达量与MMP-2/TIMP -2比值呈负相关(r=-0.7158, P<0.01)。MMP-2 mRNA和MT1-MMP mRNA的表达与各自蛋白的表达趋势一致。CTGF mRNA和TIMP-2 mRNA在正常大鼠肾脏中有低水平表达,而二者在糖尿病组从4周开始表达明显上调,其后直到12周表达持续增高。与糖尿病组相比,厄贝沙坦干预组大鼠肾脏MMP-2和MT1-MMP的表达均有不同程度提升,而TIMP-2和CTGF的表达水平则明显减低。2.高糖刺激及厄贝沙坦干预对大鼠肾小球系膜细胞MMP-2、TIMP-2、MT1-MMP和CTGF的表达的影响①免疫细胞化学检测显示MMP-2、TIMP-2和CTGF均表达于胞浆,在高糖刺激48h后系膜细胞TIMP-2和CTGF的表达明显上调,而MMP-2的表达则明显降低。免疫荧光检测显示MT1-MMP主要表达于肾小球系膜细胞胞膜。高糖组系膜细胞荧光强度较低糖组降低。与高糖组相比,10-5mol/L厄贝沙坦处理组在刺激48h后CTGF、TIMP-2表达减弱,而MMP-2和MT1-MMP的表达则增强。②蛋白印迹与半定量RT-PCR结果:高糖组MMP-2蛋白和mRNA表达在24h时较低糖组略有升高,至48h时则低于低糖组,其后随时间延长表达持续降低;MT1-MMP表达在24小时开始下降并随时间呈下降趋势;高糖组各时间点TIMP-2和CTGF表达上调,且随时间呈增高趋势。厄贝沙坦处理组在24h时MMP-2的表达低于高糖组,而与低糖组之间则无明显差异;从48h~96h厄贝沙坦处理组MMP-2表达均高于高糖组。厄贝沙坦处理组与高糖组相比各时间点CTGF、TIMP-2表达下调,MT1-MMP则表达上调。④细胞上清液检测显示,与低糖组相比,高糖组细胞上清中的IV型胶原于24 h即有增加,且持续增高至96 h;与高糖组相比,各时间点厄贝沙坦处理组IV型胶原含量明显下降(P<0.05, P<0.01)。3. SiRNA转染敲低Smad2和Smad3后系膜细胞ECM代谢相关调控因子的变化①Smad21 siRNA和Smad33 siRNA转染使系膜细胞Smad2和Smad3的表达减少约80%。Smad21 siRNA对Smad3和Smad33 siRNA对Smad2均无敲低效应,且二者对Smad4表达均无抑制。②系膜细胞在TGF-β1刺激48小时后MMP-2 mRNA和蛋白表达减少约60%-80%。Smad2敲低后,TGF-β1刺激对系膜细胞MMP-2的表达无明显影响,而Smad3敲低组和阴性对照组的系膜细胞在TGF-β1刺激后依然表现为MMP-2表达抑制。③在TGF-β1刺激48小时后系膜细胞MT1-MMP mRNA和蛋白表达减少超过60%,Smad2敲低后逆转了TGF-β1的作用,而Smad3敲低组和阴性对照组则未出现类似作用。④在TGF-β1刺激48小时后系膜细胞TIMP-2表达显著增加。与TGF-β1刺激组相比,Smad2敲低组TIMP-2表达减少约60%,Smad3敲低组TIMP-2表达减少约40%。同时敲低Smad2和Smad3则可完全抑制TGF-β1对TIMP-2的诱导作用。阴性对照siRNA对TGF-β1刺激下的系膜细胞TIMP-2的表达无影响。⑤TGF-β1刺激48小时使系膜细胞CTGF表达显著增加(蛋白增加4-5倍,mRNA增加6-7倍)。Smad3敲低可以逆转TGF-β1在系膜细胞诱导CTGF的作用,Smad2敲低和阴性对照siRNA对TGF-β1刺激下的系膜细胞CTGF的表达无影响。结论:①动物和细胞实验结果显示DN中MMP-2表达下调和活性下降伴有MT1-MMP表达减少和TIMP-2表达增多,提示MMP-2调控异常,引致其降解能力下降是导致ECM代谢障碍并发展为肾小球硬化的原因之一。②DN中CTGF表达增加,且与MMP-2/TIMP-2比值呈负相关,提示CTGF在DN中可能具有抑制ECM降解的作用。③厄贝沙坦能够减轻糖尿病大鼠肾脏病变,改善肾功能,同时减少糖尿病大鼠肾组织和系膜细胞CTGF和TIMP-2的表达,增加MMP-2和MT1-MMP的表达与活性。厄贝沙坦的肾脏保护作用可能是通过改善ECM合成/降解的平衡实现的。④TGF-β1调低系膜细胞MMP-2和MT1-MMP的表达水平的作用依赖于Smad2,对于CTGF的诱导则依赖于Smad3,而诱导TIMP-2的作用需要Smad2和Smad3的共同参与。