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巴西橡胶树是重要的热带经济作物,其胶乳产量高、质量好,是天然橡胶的主要来源。由于橡胶树是多年生异花授粉乔木,育种周期长,选育种效率受到很大的限制。随着现代分子生物学技术的发展,利用基因工程技术结合常规育种能够解决传统育种中难以突破的问题。因此迫切地需要有目的地解决目前橡胶树组织培养和遗传转化中存在的问题,完善其组织培养技术,建立稳定、高效的遗传转化体系。
本研究在综述了橡胶树组织培养及遗传转化研究进展的基础上,系统地比较了橡胶花药和未授粉胚珠愈伤组织诱导及体细胞胚胎发生能力,对橡胶树不同离体组织进行荧光背景检测,将在植物胚胎发育时期起重要作用的BBM基因导入橡胶树,对电激法转化游离小孢子细胞以及农杆菌介导花药愈伤组织进行初步探索。初步研究结果如下:
1、橡胶组织培养中,相同的品种海垦2,以花药为外植体的污染率较高,达31%,而以未授粉胚珠为外植体没有污染现象发生;从雌花中挑取胚珠较容易,且每枚雌花中含有3粒胚珠,接种效率高于花药培养;花药与未授粉胚珠分化愈伤组织的能力无明显差异;花药愈伤胚胎发生能力强于未授粉胚珠,相同的橡胶品种不同的外植体,其胚胎发生能力差异较大。就目前来说,在橡胶遗传转化研究中选择花药为受体进行转化效果较好。
2、目前尚未有以GFP作为报告基因转化橡胶树的报道,我们研究了GFP基因在橡胶树遗传转化中利用的可能性。在荧光背景检测中发现,除叶肉细胞外,橡胶树花药愈伤组织、未授粉胚珠愈伤组织、游离小孢子、花药壁体细胞均能发出极强的绿色荧光,叶片侧脉细胞也发出弱的绿色荧光。这表明橡胶树愈伤组织、游离小孢子、花药壁体细胞、叶片侧脉细胞含有自发荧光物质,在以它们为受体构建转化体系时不能以GFP基因作为报告基因。
3、小孢子及其胚胎是基因工程的优良受体,橡胶树小孢子的再生体系目前还处于初步摸索中。本试验克隆了拟南芥胚胎发生相关基因BBM的cDNA,构建了植物表达载体pBIBBM,用电激法将其导入橡胶树小孢子,检测到GUS的瞬时表达,对橡胶游离小孢子细胞的基因工程进行了初步探索。另外用农杆菌介导法将表达载体pBIBBM导入橡胶树花药愈伤组织,转化愈伤组织检测到GUS基因的表达。