白内障是世界范围内的主要致盲原因,目前尚没有有效的药物治疗手段可以完全阻止或者延缓其进展,通过手术摘除白内障是最主要的治疗方法。早期临床资料显示,约有41%的白内障患者术后会出现后发性白内障（after cataract,又称后囊膜混浊,posterior capsular opacification,PCO）[1]。随着手术技术的改进和人工晶状体的改良,PCO的发生率有所下降,但目前仍约有20%～25%的术后患者发生PCO[2,3]。PCO是现代白内障摘除术后的主要并发症,也是影响术后视力的主要原因,在一定程度上影响了手术治疗的效果[4]。发生PCO和需要行二次激光手术的患者主要是年轻人,尤其是儿童,而且激光手术还具有一定的风险（如视网膜脱离,黄斑囊样水肿等）。因此,明确PCO的发病机理,从而寻求更为安全有效的防治方法是非常重要的。许多因素对后囊混浊的发生有影响,包括复杂的、有创的手术,残留的晶状体上皮细胞（lens epithelial cells,LECs）及皮质,血—房水屏障破坏释放的炎症介质,术中植入的人工晶状体的材料、设计及植入的位置等[5,6]。目前对PCO发生机制的研究认为,术后残留的LECs增殖、上皮间质转分化（epithelial mesenchymaltransition,EMT）以及细胞外基质（extracellular matrix,ECM）是引起PCO的主要原因[7]。晶状体上皮细胞间质转分化是指晶状体上皮细胞由上皮细胞向间质转分化,出现类肌纤维母细胞样的特征,以上皮细胞极性的丧失及间质特性的获得为主要特征,是前囊膜下白内障（anterior subcapsular cataract,ASC）和PCO的主要病理改变[8-10]。迄今为止,尚未完全明确刺激晶状体上皮细胞异常增殖、转分化发生以及细胞外基质产生的信号因子,但在离体后发障模型中的研究已证实多种调控因素参与了PCO的发生过程,包括转化生长因子β（transforming growthfactor-β,TGF-β）、成纤维生长因子（fibroblast growth factor,FGF）和表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）等。其中,TGF-β在调节细胞增殖、转分化和细胞外基质的产生中起着至关重要的作用[11]。作为TGF-β细胞因子超家族的成员,TGF-β调节多种靶基因的表达,在胚胎生长发育、细胞分化、增殖及凋亡的调节中发挥着重要作用。正常情况下TGF-β在人房水、玻璃体和晶状体中均有表达,且多以无活性的潜伏型存在,免疫、炎症、创伤和手术等情况下均能诱导其激活,活化后的TGF-β对晶状体上皮细胞的生理性和病理性的分化起着关键的作用[12-14]。至今为止共发现有5种TGF-β的同源异构体,分别为TGF-β_1～5,只有TGF-β₁、TGF-β₂和TGF-β₃存在于哺乳动物中。TGF-β的三种同源异构体均可诱导晶状体上皮细胞发生转分化,但TGF-β₂则是其中效价最高的一个亚型,作用强达TGF-β₁的10倍以上[13]。各种眼球疾病均能够引起房水中TGF-β₂水平发生不同程度的改变,TGF-β₂的活化比例约占11%～61%[15-20]。Jampel等报道白内障手术中房水中TGF-p浓度为2.3～8.1ng/m1,其中61%有活性,绝大部分为TGF-p2[21]。1994年,Liu等首次发现TGF-β可诱导鼠晶状体上皮细胞产生丰富的细胞外基质成分,之后Hales等也相继报道TGF-β可诱导LECs表达α-SMA,引起晶体囊袋的皱缩,诱导LECs发生斑块聚集和梭形变化,这些改变与ASC和PCO的病理变化非常类似[22-24]。此后,晶状体上皮细胞间质转分化在白内障中的作用受到人们的日益关注[25-28]。TGF-β受体下游有多种信号转导分子,其中最主要的是Smads蛋白[29-31]。TGF-β信号通过结合在膜上的丝氨酸/苏氨酸激酶受体介导,受体激活后再磷酸化Smad移位细胞核及触发转录活性。除此之外,已有研究发现,TGF-β还激活Ras/APK和RhoA等多种信号转导途径,参与了细胞增殖、转化和凋亡等多种生命活动[32-34]。磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）是生长因子受体超家族信号转导过程中重要的细胞成员,在体内可被多种细胞因子激活,蛋白激酶B/Akt（protein kinase B/Akt,PKB/Akt）是PI3K下游的一个重要蛋白激酶。PI3K与下游分子Akt的PH区结合,从而导致Akt构象也发生改变,并从胞浆转位到质膜,使得Ser⁴⁷³和/或Thr³⁰⁸位点磷酸化激活[35,36]。PI3K/Akt通路在细胞增殖、分化、新陈代谢及凋亡过程有着重要作用,已有研究报道PI3K/Akt参与了多种细胞因子的致纤维化过程[37],但其是否也参与TGF-β介导的晶状体上皮细胞间质转分化过程仍未见报道。前期的研究发现,TGF-β不仅与ASC的形成密切相关,而且还是诱发PCO的重要因素。尽管目前对于TGF-β与LECs之间的相互作用得到广泛研究,但具体作用机制尚未完全明了。因此,明确TGF-β这一眼内重要的细胞因子对晶状体上皮细胞上皮间质转分化过程中的作用及机理,不仅对于研究PCO形成,而且对于研究某些白内障的形成机理,都具有重要的意义。本研究在总结以往TGF-β与白内障相关性研究的基础上,就TGF-β₂对晶状体上皮细胞增殖和转分化的作用进行了分析,建立了PCO的离体研究模型,并发现PI3K/Akt及其介导的蛋白激酶通路在TGF-β₂诱导的晶状体上皮细胞间质转分化过程中具有重要的调控作用,对于全面阐明TGF-β₂对晶状体上皮细胞间质转分化的作用机理做出了积极的工作。第一部分转化生长因子β₂对人晶状体上皮细胞增殖及上皮间质转分化的作用【研究目的】研究转化生长因子β₂（transforming growth factor-β₂,TGF-β₂）对人晶状体上皮细胞增殖及上皮间质转分化（epithelial mesenchymal transiIion,EMT）的作用,建立后发性白内障（posteror capsular opacification,PCO）的离体研究模型,为全面明确TGF-β₂对晶状体上皮细胞间质转分化的作用机制提供基础。【研究方法】体外培养的人晶状体上皮细胞株HLE B-3,用不同浓度的TGF-β₂处理后,分别采用MTT法测定其对细胞增殖的影响;应用PI细胞周期染色分析检测细胞周期的改变;应用共聚焦显微镜、RT-PCR法和免疫印迹法观察和分析晶状体上皮细胞中缝隙连接蛋白（connexin43,CX43）、纤维连接蛋白（fibronectin,Fn）、结蛋白（desmin）和整合素β1（integrinβ1）等细胞转分化相关基因和蛋白的变化。【研究结果】TGF-β₂是晶状体上皮细胞重要的促转分化生长因子。TGF-β₂对晶状体上皮细胞增殖起明显的抑制作用,且呈现时间和浓度的依赖性,当浓度为100 pg/ml时,这种抑制作用达到了平台期。TGF-β₂刺激后S期的晶状体上皮细胞数量明显降低,而G1期细胞数量明显增加。TGF-β₂诱导后的细胞由单层立方形变为长梭形,呈纤维细胞样形态。TGF-β₂不仅能够显著地下调晶状体上皮细胞特征基因connexin43的表达,而且能够促使细胞外间质成分fibronectin、desmin和integrinβ1表达的增多。【研究结论】TGF-β₂能够明显抑制晶状体上皮细胞的增殖,限制了细胞周期的正常进程,使得细胞处于异常增殖的状态。TGF-β₂能够诱导晶状体上皮细胞形态发生改变,细胞上皮特征逐渐丧失,获得间质细胞的特性,促使细胞由上皮向间质转分化,成功构建后发性白内障的离体研究模型。第二部分PI3K/Akt通路参与转化生长因子β₂诱导人晶状体上皮细胞间质转分化过程【研究目的】在第一部分实验的基础上我们发现,用TGF-β₂处理晶状体上皮细胞后,细胞增殖受到抑制,大部分细胞出现上皮间质转分化,而这种现象与PCO的形成密切相关,明确其调控机制有助于维持晶状体上皮细胞正常的结构与功能。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/Akt通路在增殖、分化、新陈代谢和凋亡等细胞活动过程中起着重要作用。因此,本部分的研究目的是研究MAPK和PI3K/Akt信号通路是否参与TGF-β₂诱导的晶状体上皮细胞间质转分化过程及其相关的作用机制,进一步分析和阐明TGF-β₂促进PCO形成的机理。【研究方法】培养的人晶状体上皮细胞株HLE B-3,用100 pg/ml的TGF-β₂处理后,收集处理后的细胞。应用免疫印迹法检测TGF-β₂对晶状体上皮细胞内磷酸化和总p38MAPK、ERK1/2及Akt水平的变化。加用PI3K特异性抑制剂LY294002阻断PI3K/Akt信号通路,分别采用共聚焦显微镜和免疫印迹法观察和分析connexin43、fibronectin、desmin和integrinβ1等细胞转分化相关蛋白表达的变化。【研究结果】TGF-β₂刺激后晶状体上皮细胞ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化水平稍有增加,但与对照组相比无统计学差异。TGF-β₂可以促使Akt磷酸化水平明显升高（P＜0.05）,激活晶状体上皮细胞内的PI3K/Akt通路。加用PI3K特异性抑制剂LY294002干预后,connexin43的表达则较单用TGF-β₂组明显升高,两者相比有明显的统计学差异（P＜0.05）,desmin蛋白的表达较单用TGF-β₂组减少,但两组相比无显著统计学差异。TGF-β₂诱导的fibronectin和integrinβ1表达的上调也可被LY294002有效地抑制。【研究结论】TGF-β₂能够激活PI3K/Akt信号转导通路,从而参与了TGF-β₂诱导的晶状体上皮细胞间质转分化过程。阻断PI3K/Akt信号通路可有效地抑制TGF-β₂诱导的上皮间质转分化进程,从而抑制TGF-β₂参与的后发性白内障的发生。