第一部分:树突细胞成熟与小鼠变应性鼻炎关系的研究　　 目的:利用卵清蛋白建立变应性鼻炎小鼠动物模型,探讨树突细胞成熟与变应性鼻炎的关系。　　 方法:选用BALB/C小鼠,采用OVA腹腔注射方法致敏小鼠,以1％OVA激发建立小鼠模型。HE染色观察鼻粘膜局部嗜酸性粒细胞等的浸润情况,以免疫荧光法检测小鼠鼻粘膜DEC205、CD86表达情况。　　 结果:全身致敏组均出现明显连续抓鼻及持续喷嚏症状,全身致敏组均出现鼻粘膜局部嗜酸性粒细胞增多；免疫荧光结果显示小鼠树突细胞相对特异的表面标志DEC-205及成熟DC标志CD86在变应性鼻炎小鼠鼻粘膜表达显著增强。　　 结论:OVA可以成功诱发小鼠变应性鼻炎的发生,树突细胞参与OVA诱发小鼠变应性鼻炎的过程,树突细胞在鼻粘膜局部的增多和成熟可能对变应性鼻炎发生起重要作用。　　 第二部分:变应原对树突细胞TOLL样受体表达的影响　　 目的:探讨OVA抗原刺激剂量与树突细胞成熟的关系。研究OVA抗原刺激对树突细胞模式识别受体TLR1～9(Toll-like receptorl～9)表达的影响,筛选可能在树突细胞递呈OVA抗原过程中起主要作用的TLR。　　 方法:取BALB/C小鼠骨髓细胞,利用GM-CSF和IL-4联合培养,观察树突细胞的形态,FACS检测树突细胞表面标志CD11C、CD80、CD86、MHC-Ⅱ,并观察OVA剂量与树突细胞成熟的关系；DC培养第7天分别加入10μg/ml、100μg/ml、1000μg/ml OVA溶液至6孔板,刺激24小时后收集各组细胞,制备RNA样品,RT-PCR检测TLR1～9的表达。根据RT-PCR结果利用Western blot检测相关的TLR的蛋白表达情况。　　 结果:培养的树突细胞从第四天开始出现小的毛刺状突起,呈悬浮或半贴壁集簇状生长,随着时间延长,悬浮细胞逐渐增多。OVA刺激24小时之后,共刺激分子CD80和CD86以及MHC-Ⅱ表达均增加,且随着OVA刺激剂量的增加而表达逐渐增强,提示树突细胞随OVA刺激剂量的增加而愈趋向成熟。按照control组、10μg/ml组、100μg/ml组、1000μg/ml组顺序,FACS检测结果:CD11C为77.47±2.47％、80.53±2.74％、80.30±0.70％、79.31±2.10％；CD80为46.57±0.59、77.37±0.64％、82.27±1.19％、91.50±0.75％；CD86为7.43±0.67％、47.30±2.07％、66.37±1.32％、89.93±1.05％:MHC-Ⅱ为25.57±0.61％、82.27±0.35％、85.63±1.03％、95.57±0.59％。RT-PCR检测到小鼠骨髓来源树突细胞表达TLR1～9,TLR2、3、4的表达明显,且随着OVA刺激剂量增加,TLR2的表达出现明显增强,而TLR1、3、4、5、6、9的表达各组间无显著差异。TLR7、8表达在10μg/ml组出现明显增强,随着OVA剂量增加,表达反而降低。Western blot检测结果同样显示TLR2表达随OVA剂量增加而增强。　　 结论:　　 通过GM-CSF和IL-4的联合作用,结合合理的培养方法,可获得足量的、纯度较高的树突细胞；　　 在体外试验中,树突细胞可以直接识别捕获OVA,在OVA刺激下逐渐成熟,成熟的DC其共刺激分子CD80、CD86及MHC-Ⅱ的表达增高,具有了刺激T淋巴细胞增值分化的能力。　　 OVA上调DC TLR2的表达。TLR2信号途径可能参与了OVA诱导树突细胞成熟及抗原递呈过程。　　 第三部分:TLR2和MR RNAi对小鼠树突细胞抗原内吞作用和树突细胞成熟的影响　　 目的:通过调节树突细胞抗原内吞或递呈相关的MR和TLR2的表达,观察其对树突细胞活化成熟及相关细胞因子表达的影响,分析两者在DC抗原递呈中的可能作用,探讨DC表面介导糖蛋白类变应原识别及内吞的可能受体。　　 方法:利用Lipofectamine2000脂质体转染试剂将TLR2 SiRNA序列和MRSiRNA序列转染进树突细胞,RT-PCR检测RNA干扰的效果。利用FITC-OVA观察树突细胞内吞OVA的情况,并同时行FACS检测树突细胞内吞。FITC-OVA的程度；通过FACS检测CD86表达来观察TLR2 RNAi和MR RNAi对小鼠树突细胞接受OVA及尘螨等糖蛋白类变应原刺激后成熟状态的影响。　　 结果:利用NC-FAM转染后荧光显微镜下观察转染效率,转染效率为87.5％以上。通过RNAi成功抑制树突细胞TLR2和MR的表达。MR RNAi可以明显抑制树突细胞对FITC-OVA内吞作用,限制树突细胞的成熟。TLR2 RNAi尽管可以抑制TLR2表达达50％以上,然而对树突细胞内吞变应原的作用无明显影响。特别是MR RNAi同样可以抑制屋尘螨粉尘满混合变应原诱导的树突细胞成熟过程。OVA刺激后树突细胞分泌IL-10增多,分泌IL-12减少,而RNAi抑制小鼠树突细胞TLR2和MR的表达可以抑制OVA刺激引起的树突细胞IL—10和IL-12的这种变化趋势,即抑制DC细胞因子IL—10的分泌,并上调IL-12水平。　　 结论:　　 抑制MR的表达,可以抑制树突细胞对OVA抗原的内吞作用；　　 下调MR表达,可以抑制OVA及尘螨诱导的DC成熟；　　 TLR2 RNAi不影响DC对OVA的内吞,但可抑制DC细胞因子IL-10的分泌,并上调IL-12水平。；　　 MR可能是介导DC对环境变应原识别及内吞的关键模式识别受体。