小麦禾谷孢囊线虫(Cereal Cyst Nematode,CCN)在我国的危害日益严重,但是目前生产上主推的小麦品种普遍抗性较差,没有高效低毒的化学杀线剂,休耕及轮作等农业措施在我国难以实施,亟需一种经济有效的防治方法。生物防治是通过天敌生物控制线虫的数量或者减轻线虫的危害程度,不会打破生态平衡,也不会引起线虫产生抗性,为防控植物寄生线虫病害提供了一条新思路。生防菌株的的作用效果取决于施用菌剂的生态环境条件和发生线虫的种类。因此,筛选出适应当地生态环境的生防菌株,追踪菌株在土壤中的定殖情况,并通过研究外源施入生防菌对土壤中土著微生物菌群的多样性和群落结构的影响对生防菌株进行风险评估,对生防菌剂的合理开发和使用具有重要的指导意义。鉴于此,本文主要包括以下研究内容:(1)小麦孢囊线虫生防菌株的鉴定及防效测定。课题组前期筛选出四株对小麦孢囊线虫病有较好防治效果的生防菌株,本文通过形态学、分子生物学和生理生化方法对其进行种类鉴定,生防真菌08F04菌株被鉴定为球孢白僵菌(Beauveria bassiana),生防细菌细菌09B18菌株被鉴定为蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus),生防细菌09X01菌株被鉴定为木糖氧化无色菌(Achromobacter xylosoxidans),生防放线菌S07菌株被鉴定为环状链霉菌(Streptomyces anulatus),四种生防菌在小麦孢囊线虫病的生物防治中均是首先发现和报道。室内盆栽试验发现08F04麦粒砂处理、S07麦粒砂处理,细菌09B18和09X01拌种处理在温室条件下对菲利普孢囊线虫都具有较好的防治效果,孢囊减退率都能达到50%以上。进一步在许昌和郑州小麦孢囊线虫重发地块进行了连续两年的田间防效试验,发现08F04麦粒砂处理和S07麦粒砂处理对小麦孢囊线虫的田间防治效果的稳定性高于细菌09B18和09X01拌种处理,孢囊减退率都达到40%以上。并且08F04麦粒砂处理和S07麦粒砂处理对小麦的鲜重具有较好的促进作用和明显的增产作用。以上结果说明08F04菌株和S07菌株对小麦孢囊线虫病的防效比较稳定且对小麦植株相对安全,具有较好的开发应用前景。因为真菌08F04菌株具有易培养,生长速度快的优点,所以筛选出08F04菌株进行后续研究。(2)球孢白僵菌08F04菌株在土壤中的定殖规律。通过实时荧光定量PCR和稀释平板计数监测sgfp和hph双基因标记的球孢白僵菌株08F04菌株转化子在室内盆栽中的消长规律,研究08F04菌株在土壤中的定殖情况。首先,对球孢白僵菌株08F04菌株进行农杆菌遗传转化,将含有sgfp和hph基因的真菌表达载体p CAM-gfp转入08F04菌株中,通过PCR和southern杂交验证绿色荧光蛋白基因sgfp的表达元件已经稳定的整合到了球孢白僵菌株08F04的基因组中且为单拷贝,最终获得了能够稳定遗传,菌落形态、生长速度以及寄生能力与野生菌株一致的转化子G10。构建G10转化子的实时荧光定量PCR检测体系,然后通过室内盆栽试验测定接种G10菌株0-6周后每克土壤中sgfp基因的拷贝数,并通过稀释涂板法调查含潮霉素的平板上的菌落数(CFU),结果显示,土壤中sgfp基因的拷贝数和平板上的菌落数的变化趋势一致,且呈一定的线性关系,拟合方程为y=0.398+0.91x(R2=0.7995,y-基因拷贝数,x-平板上生长的菌落数)。08F04菌株的生物量在土壤中呈先增加后减少的趋势,接种后第3周其在土壤中的定殖量达到最大(3.8×105 copies/g)。所以,为了获得最优的防治效果,可以在播种后第3周补施生防菌。(3)球孢白僵菌08F04菌株对土壤微生物多样性的的影响。为了研究球孢白僵菌08F04菌株对小麦不同生育期的根际土壤中微生物多样性的影响,利用第二代高通量测序技术分别测定了郑州和许昌病田中施入08F04菌株后,土著真菌菌群和细菌菌群的变化情况。结果显示,外源施用08F04菌株对土壤中真菌的物种总数没有显著影响,虽然前期对土壤真菌的多样性有一定的抑制作用,但是后期处理样品中微生物的多样性恢复到了正常水平。而外源生防菌株08F04的施用对土壤中细菌菌群的物种数和多样性都没有显著影响。另外PCA结果显示,小麦不同生育期对微生物多样性的影响大于生防菌株的施用对其的影响。高通量测序结果发现球孢白僵菌株08F04菌株对郑州和许昌两地土壤中角担菌(Ceratobasidium)和链格孢(Alternaria)的丰度有明显的减少作用,角担菌(Ceratobasidium)是小麦纹枯病病原菌立枯丝核菌的有性态,链格孢(Alternaria)是引起小麦黑胚病和叶枯病的病原菌,由此可以推测,球孢白僵菌株08F04菌株在防治小麦孢囊线虫病的同时,还能够抑制多种小麦真菌病害的发生。另外,施用球孢白僵菌株08F04菌株增加了土壤中粘帚霉属(Clonostachys)的丰度,而粘帚霉属(Clonostachys)是植物寄生线虫的一种重要生防菌,在土壤中可能会与球孢白僵菌株08F04菌株协同抑制小麦孢囊线虫病的发生与危害。以上结果说明球孢白僵菌株08F04菌株对土壤微生态环境是相对安全的,投入自然环境中不会破坏生态平衡,在防治小麦孢囊线虫病方面具有较大开发利用价值。