肺癌是导致人类死亡的首要恶性肿瘤。据肿瘤学权威杂志CA:a cancer journal for clinicians报道,2014年美国所有新发肿瘤病例中,肺癌患者病例数占14%,在男性患者和女性患者中仅次于前列腺癌和乳腺癌所占比例;而在同年所有因肿瘤导致死亡的患者中,肺癌所占比例为27%,远高于排第二位的前列腺癌(10%)和乳腺癌(15%)。在我国,国家癌症登记中心(National Central Cancer Registry,NCCR)2015年发布的中国肿瘤年报显示,新发肺癌病例占2011年所有新发肿瘤病例的19.31%,肺癌致死病例占所有肿瘤致死病例的25.04%,其发生率和致死率均居各种肿瘤的首位。近年来,由于我国空气污染、雾霾问题日趋严重,罹患呼吸系统疾病的人数逐年增长。尽管目前国内尚未有大规模的流行病学研究雾霾与肺癌发生之间的关系,但2013年《柳叶刀-肿瘤学》(The Lancet Oncology)杂志发表的欧洲空气污染对人群影响的多中心队列研究(multicentre European Study of Cohorts for Air Pollution Effects,ESCAPE)结果显示,空气中细颗粒物2.5(particulate matter 2.5,PM2.5)及PM10含量升高可增加肺腺癌发生的风险比(hazard ratio,HR)。随着肺癌分子生物学研究的不断深入,调控肺癌发生发展的分子生物学靶点不断被发现,靶向肺癌细胞内外信号转导过程的分子靶向药物越来越多的被应用于肺癌的临床治疗。尽管当前分子靶向治疗、基因治疗、细胞免疫治疗等新技术在肺癌治疗中取得了较好的疗效,但肺癌总体的5年生存率仅有16%。因此,探索并发现与肺癌发生发展相关的重要分子靶点对于肺癌的预防、早期发现、早期诊断、早期治疗,以及预后评估具有重要的意义。长期反复发作的慢性炎症是引起细胞发生恶变,导致肿瘤形成的重要原因。迄今为止,肿瘤相关性炎症(cancer-related inflammastion)已成为学术界公认的除永生性、转移性、无接触抑制、生长信号过度激活、凋亡逃逸、持续的血管新生外肿瘤的第七种生物学特性。肿瘤相关性炎症在肿瘤的发生发展中主要表现在两个方面:一方面,慢性炎症反应可通过破坏正常组织的基因稳定性引起基因突变,促进原癌基因表达,抑制肿瘤免疫监视等过程促进肿瘤发生(carcinogenesis);另一方面,某些类型的肿瘤在产生后可以诱导其生长的微环境中形成持续的炎症反应。无论肿瘤微环境中的炎症反应起源如何,其均可促进肿瘤细胞增殖、转移以及血管新生,并抑制特异性免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤,促进肿瘤耐药形成。因此,发现“炎癌转化”过程中的关键分子,一方面有助于抑制肿瘤相关性炎症的形成,另一方面可为开发基于调控肿瘤相关性炎症的治疗药物提供新靶点。肺纤维化(pulmonaryfibrosis)是弥漫性间质性肺疾病的简称,是一种呼吸系统的常见疾病,其病理特征是肺泡壁(包括呼吸性细支气管)弥漫性慢性炎症和间质纤维化。持续的慢性炎症反应是肺纤维化发生发展的主要机制之一。此类疾病的早期反应表现为肺泡和肺泡壁内炎性反应,形成肺泡炎。随着疾病的进展,炎症逐渐蔓延到邻近的肺间质部分和血管,并诱导纤维母细胞活化增殖,大量分泌纤维蛋白并沉积于肺间质内,产生间质纤维化。随着肺纤维化逐渐加重,肺组织破坏逐渐加剧,出现明显的气体交换功能损害,肺通气功能降低,患者最终死于呼吸衰竭。引起肺纤维化的原因众多,部分病因明确,其他则病因不明。目前,已知导致肺纤维化的明确的原因主要包括:职业或环境因素相关的无机或有机粉尘以及有害化学物质的吸入,如石棉、硅石、金属颗粒、霉草尘、棉尘、烟尘、二氧化硫等;病毒、细菌、真菌、寄生虫感染;某些特殊药物及放射性损伤。由于我国空气环境污染问题严重,人们在日常生活中吸入上述可诱导肺间质纤维化的物质的机会升高,从而导致肺间质纤维化的发病率上升。除各种损伤、抗原物质刺激引起的慢性炎症反应外,研究发现,肺泡毛细血管屏障基底膜完整性的破坏、上皮细胞和内皮细胞的再生修复功能抑制、转化生长因子-β(transformationgrowthfactor-β,tgf-β)信号功能异常均参与了肺间质纤维化的形成。尤其值得注意的是,近年来的研究已经证实,上皮细胞向间充质细胞转化(endothelial-to-mesenchymaltransition,emt)是纤肺维化过程中重要的细胞机制。肺间质纤维化的预后差,且目前尚无特效药物能够阻断其疾病进程。因此,进一步深入研究肺纤维化的形成机制,发现参与调节肺纤维化进程的重要靶点,将有助于今后新型抗肺纤维化药物的开发。炎症小体(inflammasome)是由细胞内多种蛋白在内源性或外源性应激作用下组装形成的复合体,其激活后可产生具有生物学活性的caspase-1,后者可进一步通过剪切作用激活炎症因子il-1β和il-18。成熟的il-1β和il-18释放至细胞外产生促炎作用。“炎症小体”这一概念最早由tschopp等人于2002年提出。经典的炎性小体由三部分构成:1)核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-bindingoligomerizationdomain,nod)样受体(nod-likereceptors,nlr)或者黑色素瘤缺乏因子-2样受体(absentinmelanoma2-likereceptor,alr),作为形成炎症小体的框架蛋白或作为应激信号感受器;2)凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingacard,asc),在炎症小体组装过程中作为接头蛋白;3)半胱天冬蛋白酶-1(caspase-1),其经剪切活化后可进一步剪切il-1β和il-18前体,形成成熟的il-1β和il-18。现已证实,感染或损伤等因素导致炎症小体的持续激活是形成慢性炎症的重要分子生物学基础。近年来的研究表明,炎症小体在消化系统肿瘤、前列腺癌和黑素瘤的发生和发展过程中发挥重要作用。然而,炎症小体在肺癌的形成和发展过程中具有何种作用尚不明确。此外,已有的研究表明,二氧化硅(sillica,sio2)晶体是诱导nlrp3炎症小体活化的激活剂之一。而二氧化硅颗粒是空气污染物中的主要成分之一,并且是导致职业相关性肺纤维化的主要因素之一。动物实验发现,敲除nlrp3基因可抑制小鼠吸入sio2微粒所致的小鼠肺部肉芽肿形成,降低胶原沉积和肺纤维化。而作为肺间质纤维化过程中的重要细胞调控机制,上皮细胞向间充质细胞转化(endothelial-to-mesenchymaltransition,emt)过程是否受nlrp3炎症小体调控尚不明确。因此,本文第一部分工作研究炎症小体在人源性肺癌细胞株中的表达及活性;第二部工作分采用肺癌患者手术切除的肺癌标本,研究炎症小体在肺癌组织中的表达和活化情况;第三部分工作研究nlrp3炎症小体在二氧化硅(sio2)pm2.5颗粒诱导支气管上皮细胞株发生上皮细胞向间质细胞的转变(epithelialtomesenchymaltransition,emt)过程中的作用;第四部分工作使用肺活检样本研究nlrp3炎症小体在一例利妥昔单抗(rituximab,美罗华)所致间质性肺病中的作用。本文工作开拓了炎症小体在呼吸系统疾病研究的新领域,深化了对炎症小体病理生理学功能的认识,揭示了炎症小体是调节肺癌细胞生物学行为的重要分子,并且在肺纤维化过程中发挥重要的调控作用,为研发针对肿瘤相关炎症的治疗和抗肺纤维化药物提供新的靶标。第一部分炎症小体在人肺癌细胞株中的表达目的:研究不同亚型炎症小体及活化产物在不同细胞类型、不同转移能力以及不同化疗敏感性的肺癌细胞株中的表达丰度及其活化后产生炎症因子il-1β的能力。方法:培养正常人源性肺泡上皮细胞株hpaepics(humanpulmonaryalveolarepithelialcells),正常人支气管上皮细胞株16hbe(humanbronchiepithelialcellline),人肺泡上皮腺癌细胞株a549(humanalveolarepithelialadenocarcinomacellline)及耐顺铂a549/ddp细胞株,人肺鳞癌细胞株sk-mes-1(humanlungsquamouscellcancerline),人大细胞肺癌低转移能力95c细胞株和高转移能力95d细胞株[humanlarge-celllungcarcinomacelllineswithlow(95c)orhigh(95d)metastaticpotential],人小细胞肺癌细胞株nci-h446(humansmallcelllungcancercellline);采用定量实时多聚酶链式反应(quantitativereal-timepolymerasechainreaction,qrt-pcr)及蛋白质印记法(westernblotting)测定构成炎症小体的不同组分,包括nod样受体nalp1,nlrp3,nlrc4,aim2,asc,caspase-1以及il-1β和il-18前体及成熟体的表达。采用炭疽致死因子(anthraxlethalfactor,lf),短链同聚双链dna(doublestraineddna,dsdna)片段poly(da:dt),脂多糖(lipopolysaccharides,lps)联合三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate,atp),鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白(flagellinfroms.typhimurium)分别活化各细胞株内的nalp1,aim2,nlrp3及nlrc4炎症小体,测定细胞上清液中il-1β水平。结果:构成炎症小体的不同组分在正常肺源性细胞株及肺癌细胞株内均有表达。其中,nalp1高表达于16hbe、a549及nci-h446细胞株,中等表达于a549/ddp、sk-mes-1及95d细胞株,低表达于hpaepics及95c细胞株;aim2高表达于非小细胞肺癌细胞株;nlrp3高表达于a549、95c、95d及nci-h446细胞株;nlrc4在各细胞株间表达水平经统计学检验差异无显著性;asc在a549、95d及nci-h446细胞株中表达水平显著高于两种正常肺源性细胞株(hpaepics和16hbe);pro-caspase-1、pro-il-1β和pro-il-18mrna在各组细胞株表达水平差异统计学检验无显著性,但在肺癌细胞株中caspase-1活化体p10及il-1β和il-18成熟体蛋白水平显著高于正常肺源性细胞株。值得注意的是,在非小细胞肺癌细胞株中,鳞癌细胞株sk-mes-1表达aim2、nlrp3、asc、caspase-1活化体、il-1β和il-18成熟体的蛋白水平低于腺癌a549及大细胞肺癌95d细胞株;耐顺铂a549/ddp细胞株表达aim2、nlrp3、asc及il-1β和il-18成熟体的蛋白水平显著低于野生型a549细胞株;低转移性大细胞肺癌95c细胞株表达nalp1、aim2、asc、caspase-1活化体、il-1β和il-18成熟体的蛋白水平显著低于高转移性大细胞肺癌95d细胞株。elisa结果显示,各种细胞株内的炎症小体激活后均可释放il-1β,肺癌细胞释放能力强于正常细胞,且nlrp3炎症小体激活后释放il-1β的能力高于其他亚型的炎症小体。结论:炎症小体差异性表达于肺癌细胞株,其主要表达亚型及表达水平与肺癌细胞株的细胞学类型、转移能力及化疗敏感性相关;表达于肺癌细胞株的不同亚型炎症小体可被相应的激活剂活化,促进炎症因子il-1β的释放。第二部分炎症小体在手术切除的i期肺癌组织中的表达目的:研究不同亚型炎症小体及其活化产物在手术切除的i期肺鳞癌、腺癌及局限期小细胞肺癌样本中的表达水平,揭示肺癌病灶内炎症小体与不同病理类型肺癌的相关性。方法:从南京医科大学第一附属医院肿瘤样品组织库中调取液氮冻存的2011年1月至2012年12月间手术切除的i期肺癌患者(小细胞肺癌为局限期患者)肺组织样本用于qrt-pcr研究,包含17例鳞状细胞癌(squamouscellcancer,scc);20例低级别肺腺癌(i-ii级,low-gradeadenocarcinoma,low-gradeadc);16例高级别肺腺癌(iii-iv级,high-gradeadenocarcinoma,high-gradeadc);8例小细胞肺癌(smallcelllungcancer,sclc);同时每组中随机选取5例肿瘤样本的癌旁正常组织(共计20例)组成对照组。此外,从我院病理科另外选取各4例上述病理类型肺癌手术切除组织的石蜡切片进行免疫组化研究。通过免疫组织化学、qrt-pcr及westernblotting法检测构成炎症小体的不同蛋白,包括nalp1、aim2、nlrp3、nlrc4、asc、caspase-1以及il-1β和il-18的表达。结果:在癌旁正常组织中,构成炎症小体的nalp1、aim2、nlrp3、nlrc4、asc、caspase-1、il-1β及il-18表达水平低。qrt-pcr可检测出nalp1及nlrc4在不同组织中的mrna表达,且各组织中mrna的含量统计学检验差异无显著性,但免疫组化研究在癌旁正常组织及各肺癌组织中均未检测出nalp1及nlrc4的阳性表达信号。aim2、nlrp3及asc在肺癌组织中的表达量显著高于癌旁正常组织。aim2高表达于腺癌样本,中度表达于鳞癌样本,在小细胞肺癌组织中表达量低;nlrp3及asc在高级别腺癌组织中表达量最高,中度表达于低级别腺癌组织及小细胞肺癌组织,在鳞癌样本中表达量相对较低。caspase-1、il-1β及il-18成熟体在肺癌细胞组织中的表达水平显著高于癌旁组织,且以高级别腺癌组织中表达水平为最高。结论:炎症小体高表达于肺癌组织,且与肿瘤病理类型相关。肺腺癌组织中炎症小体表达水平高于鳞癌,且高级别肺腺癌表达水平最高。表明高级别肺腺癌中炎症小体介导的肿瘤相关性炎症反应强于其他类型肺癌。第三部分nlrp3炎症小体在二氧化硅pm2.5诱导的支气管上皮16hbe细胞株emt中的作用目的:研究公认的nlrp3炎症小体活化剂之一——二氧化硅2.5μm细颗粒物(sio2pm2.5)是否能诱导支气管上皮细胞16hbe细胞株发生emt现象,并初步探索nlrp3炎症小体在这一过程中的作用及相关机制,揭示nlrp3炎症小体在sio2诱导的肺纤维化早期事件emt过程中的可能作用。方法:将不同浓度sio2pm2.5加入16hbe细胞培养基中,采用cck8法测定测定sio2pm2.5作用不同时间(24,48,72小时)对16hbe细胞活力的影响;检测emt发生率及emt标志性分子e-钙黏蛋白(e-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscleactin,α-sma)表达变化,评估sio2pm2.5是否能够诱导16hbe发生emt;同时测定16hbe细胞内nlrp3炎症小体活化水平;确定可引起16hbe细胞发生emt效应及nlrp3炎症小体活化的合适sio2pm2.5浓度和作用时间。采用慢病毒转染短发卡样rna(shorthairpinrna,shrna)下调16hbe细胞中nlrp3表达;研究抑制nlrp3表达对sio2pm2.5诱导16hbe发生emt效应及nlrp3炎症小体活化的影响。通过westernblotting法检测emt过程中主要信号分子smad2/3,gsk3β,β-catenin及sanil的表达情况,揭示相关分子生物学机制。结果:sio2pm2.5对16hbe细胞具有浓度和时间依赖性的毒性作用,在损伤细胞的同时可浓度和时间依赖性的诱导16hbe细胞发生emt现象。sio2pm2.5在诱导16hbe细胞发生emt效应的同时可激活细胞内nlrp3炎症小体;相同浓度的sio2pm2.5可时间依赖性的促进nlrp3炎症小体活化并释放成熟的il-1β和il-18。下调nlrp3表达后能显著抑制sio2pm2.5诱导的16hbe细胞发生emt效应,同时抑制nlrp3炎症小体表达及活化过程,表现为nlrp3上调被阻断,caspase-1活化被减弱,但不能抑制细胞外液中的il-1β和il-18水平升高。分子生物学研究显示,下调nlrp3表达可能通过抑制细胞内smad2/3-snail信号传导过程而减轻sio2pm2.5诱导16hbe细胞发生emt。结论:sio2pm2.5可诱导16hbe细胞发生emt效应的同时活化细胞内nlrp3炎症小体。下调nlrp3的表达可抑制sio2pm2.5对16hbe细胞emt的诱导作用。nlrp3炎症小体的这一作用可能是通过调节smad2/3-snail信号通路实现。因此,调控nlrp3炎症小体的表达和功能可能是预防和治疗空气污染颗粒物质对肺组织损伤、诱导肺纤维化及肺癌过程的有效策略。第四部分nlrp3炎症小体在利妥昔单抗所致间质性肺病中的作用(临床病例研究1例)目的:研究利妥昔单抗(rituximab,美罗华)所致间质性肺病(rituximab-inducedinterstitiallungdisease,r-ild)的病理学改变及nlrp3炎症小体在患者肺部病灶中的表达与分布,揭示外周血中炎症小体相关因子il-1β及il-18与肺部影像学改变的关系,为研究此类疾病的发病机制和药物治疗学机制提供分子生物学基础。方法:通过使用糖皮质激素及抗感染药物抢救一例因使用利妥昔单抗治疗特发性血小板减少性紫癜(idiopathicthrombocytopenicpurpura,itp)导致r-ild合并呼吸衰竭患者;采集患者外周血,采用elisa方法测定血清中il-1β及il-18水平在治疗过程中的动态变化;使用高分辨率ct(highresolutionct,hrct)动态观察患者肺部病灶恢复情况;患者病情改善,肺部病灶经治疗后部分吸收时,与患者及家属沟通签署知情同意,行电视辅助胸腔镜手术(video-assistedthoracoscopicsurgery,vats)取患者肺内病变残留部位及恢复部位肺组织行病理学检查;采用天狼星红染色及免疫组织化学染色法研究肺组织内纤维化改变及nlrp3、asc、caspase-1在肺组织病损部位及恢复部位中的表达。结果:患者呼吸衰竭经使用糖皮质激素及抗感染治疗后被纠正;hrct检查显示患者肺部病灶在治疗5天后部分吸收,治疗14天后病灶明显吸收,治疗45天后几乎完全吸收;治疗5天后行vats肺活检病理学结果显示,患者肺部病变为非特异性间质性肺炎(nonspecificinterstitialpneumonia,nsip),肺间质内见大量CD19阳性B淋巴细胞与浆细胞浸润;天狼星红染色可见病变部位肺间质内大量胶原纤维堆积;免疫组化染色结果可见NLRP3、ASC、caspase-1在肺组织病变部位中高表达。上述病理学改变在活检肺组织恢复部位中消失。ELISA结果显示,患者外周血中IL-1β及IL-18水平随治疗时间逐渐降低。结论:NLRP3炎症小体参与R-ILD的发生过程;糖皮质激素治疗能有效抑制R-ILD过程中肺内NLRP3炎症小体活化并逆转R-ILD过程中肺间质胶原纤维沉积;外周血中IL-1β及IL-18水平与肺组织内间质性病变恢复过程存在时间上的相关性,可能成为监测药物源性肺间质病变的分子标志物。综上所述,本研究工作的主要创新之处:1.发现不同类型肺癌细胞株与组织中炎症小体的表达情况,为肺癌中肿瘤相关性炎症提供依据;2.揭示炎症小体与肺癌细胞转移性、耐药性以及细胞病理学之间的关系,为今后开发靶向调控炎症小体表达和功能的新型肺癌辅助治疗药物提供新的靶点;3.初步阐明NLRP3炎症小体在SiO2 PM2.5诱导细胞发生EMT作用中的调节作用,为今后使用NLRP3炎症小体抑制剂预防和治疗空气污染颗粒物质所致肺损伤、纤维化以及防止后续肺癌的产生提供新的思路;4.发现NLRP3炎症小体参与利妥昔单抗所致间质性肺病的形成,丰富了对此类药物源性肺损伤疾病发病机制的认识。