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结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitate L.)是十字花科芸薹属重要的蔬菜。由于全球气候变化与集约化生产等因素,甘蓝栽培过程中遭遇非生物胁迫如干旱、低温以及生物胁迫如细菌、真菌等病害的概率大大增加,给甘蓝生产的产量和品质带来巨大的影响。农作物对逆境胁迫以及病原菌入侵的抗性响应主要是通过相关的基因的应答后产生一系列生理生化反应来实现的。之前有大量研究证明,模式植物拟南芥中AtOCP3和AtESK1分别卷入了抗干旱和低温胁迫反应,下调相应基因的表达水平或者产生的突变体能提高其抗干旱或者耐低温的水平。AtBIK1和AtLACS2基因分别参与根肿病抗性和真菌类病害灰霉病和菌核病的抗性,相应基因的突变体中大幅度提高了针对相应病害的抗性水平。因此,针对上述基因在甘蓝中的同源基因进行基因突变,获得相应的突变体,有望获得相应的抗性育种材料。CRISPR/Cas9基因编辑系统是目前使用最为普遍的高效基因定点突变工具,广泛用于获得各种农作物突变体材料,实现品种性状的快速改良以及多基因聚合。利用该系统实现目标基因突变后,可以从其自交后代群体中分离出不含Cas9基因的目标基因突变体。常见的办法是采用分子检测手段进行转基因和非转基因个体筛选,这大幅度增加了工作量和成本。因此,探索快速简易的转基因个体鉴别系统对于将CRISPR/Cas9基因编辑系统用于高通量的农作物突变体创制具有重要的价值。将可视选择标记基因引入CRISPR/Cas9基因编辑载体,在种子或者苗期阶段即可进行可视化的转基因个体和非转基因个体的甄别,无疑将大幅度提高非转基因突变体的筛选效率。因此,本研究以结球甘蓝为对象,对干旱胁迫处理后的BoOCP3基因、低温胁迫处理后的BoESK1基因、根肿病接种后的BoBIK1基因、菌核病接种处理后的BoLACS2基因表达水平进行了分析,确认其是否卷入上述生物或非生物胁迫的应答反应。在此基础上,将两个可视选择标记基因引入CRISPR/Cas9基因编辑载体构建针对上述基因的靶向编辑表达载体。两个可视选择标记基因中的一个是来自紫花菜花青素合成的关键调节基因BoMYB,将其与除草剂抗性基因BAR融合组成性表达,可在整个植株各个阶段进行转基因个体的甄别;另外一个可视选择标记基因为种子特异表达荧光蛋白mCherry基因,可在种子阶段进行转基因个体的甄别。采用农杆菌介导的遗传转化法将上述基因的靶向敲除载体导入了甘蓝自交系F416,成功实现了目标基因的敲除,获得了相应的突变体。其主要结果如下:1.甘蓝抗逆相关基因表达量分析。甘蓝自交系F416进行干旱胁迫处理后,BoOCP3表达量在胁迫后2天出现显著下调,4天后出现上调表达,并在复水后表达量上升到胁迫处理前的水平。4℃恒温培养箱中进行冷胁迫处理后的1-4天范围内,BoESK1基因表达水平稳定上升。结果说明BoOCP3参与了甘蓝干旱胁迫反应调控,而BoESK1基因参与了甘蓝的冷胁迫应答过程。2.甘蓝抗病相关基因表达量分析。甘蓝自交系F416进行菌核病接种处理后1天,BoLACS2基因表达量出现明显上升,在2天内表达水平达到最高,接种植株受害症状明显。而根肿病接种处理后,叶片中BoBIK1基因表达量在4-14天的时间段内出现稳定的上升。上述结果显示BoLACS2和基因BoBIK1分别卷入了相应病原菌在甘蓝叶片以及根部的浸染和繁殖过程。3.可视标记辅助选择基因的应用。将两个可视选择标记基因MYB和mCherry引入CRISPR/Cas9基因编辑载体后转化甘蓝后,所产生的除草剂PPT抗性愈伤组织、芽和植株中均观察到明显的红色花青素积累现象。同时在相应的红色愈伤组织或者植株中均无例外检测到了mCherry基因。显示将该可视选择标记基因引入CRISPR/Cas9基因编辑载体后未影响到转基因植株的转化筛选效率以及对植株的生长发育造成影响。4.获得ocp3/esk1突变背景甘蓝材料。针对非生物胁迫相关基因BoOCP3和BoESK1构建PCAMC-tBoOCP3/tBoESK1双基因敲除靶向载体,通过农杆菌介导法将其导入甘蓝自交不亲和系F416中,得到转基因植株20株,其中19株中检测到BoOCP3基因突变,在所有20株植株中检测到BoESK1基因发生突变,双突变效率为95%。随机挑选了5株双基因敲除植株进行单克隆测序。结果5株转基因甘蓝中的BoOCP3基因均在D位置检测到突变,仅1株在B位置检测到突变;而BoESK1基因在A,B,C三个位置均检测到突变。5.获得bik1/lacs2突变背景甘蓝材料。针对生物胁迫相关基因BoBIK1和BoLACS2构建PCAMC-tBoBIK1/t BoLACS2双基因敲除靶向载体,通过农杆菌介导法将其导入甘蓝自交不亲和系F416中,得到红色转基因愈伤组织5个与转基因植株2株,对其进行靶向基因的突变检测结果显示:BoBIK1基因突变频率为71.43%,BoLACS2基因基因突变频率为28.57%。其中在两个愈伤组织中出现了BoBIK1和BoLACS2基因的双敲除。基于单克隆测序分析发现,其中2个愈伤为BoOCP3杂合突变,BoLACS2未检测到突变类型。