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研究目的:本研究利用肾盂内高压致脓毒性休克动物(兔)模型,以蛋白质组学及质谱技术分离和鉴定脓毒性休克动物模型血液中差异表达的蛋白质,研究差异蛋白质与早期脓毒性休克的关系。动物模型结合临床样本筛选早期诊断尿源性脓毒症的新指标。研究方法:1.10只雌性新西兰兔随机分成对照组和实验组,两组均结扎一侧输尿管上段,实验组及对照组均按2ml/kg剂量分别向肾盂注射9.0 ×108cfu/ml浓度标准大肠杆菌和生理盐水,随后监护心率、血压,兔肾盂内高压致脓毒性休克模型及对照组模型建立。2.术后2h、4h、6h时间点于股动脉或兔耳正中动脉抽血(血量统一),注入等容量生理盐水+肝素。离心后,取上清液保存。血上清液标本随后进行分组蛋白质组学实验。实验结束处死兔子,将其肝、肺、肾组织进行病理学检查。3.将血清样品低丰度蛋白进行富集、洗脱,再将洗脱的蛋白质用胰酶消化成肽段。然后使用三组11-plex TMT稳定同重同位素标记来标记所有样品,标记后,将每个11plex组中的肽混合物合并,分离肽段,收集的肽段合并为10个馏分,完全干燥后,将得到的肽段在纳升液相系统进行分离。最后采用质谱检测技术进行鉴定,采集的RAW文件加载到含11plex TMT定量模块的MaxQuant软件中,搜索针对家兔的UniProt数据库及常见污染序列。然后利用分层聚类分析获得样品之间的整体蛋白质组差异。实验中只针对至少有两条特异性肽段并且在所有三组TMT实验中都检出的蛋白质ID进行定量。对筛选出的差异表达蛋白质进行蛋白质-蛋白质互作分析。目前严重脓毒症和脓毒性休克的诊断标准,常常参考欧洲脓毒症诊断标准。我们通过这一标准共收集了 20例术后脓毒症患者和21例非脓毒症患者的血清样本进行靶向蛋白组学验证,然后对验证出的蛋白一一进行ROC曲线分析,并通过多因素logistic回归分析建立诊断模型。结果:实验组平均动脉压在2h,4h,6h不断下降,术后6小时达到脓毒性休克,有统计学差异(p<0.05)。对照组血压无明显下降。兔子肝、肺、肾组织进行病理学检查发现实验组肝肺肾组织有明显的炎症细胞浸润,对照组无此改变。两组样本的蛋白质组学研究显示,三个时间点两组比较中早期表达有差异的蛋白205个,晚期表达有差异的196个蛋白。三个时间点表达变化趋势均一致的差异蛋白(都上调或都下调)有 6 个分别为:Cystatin-C、Cubilin、IGFBP5、SERPINF1、CLU、LBP。早期表达有差异,但晚期无差异且>1.5倍表达蛋白共9个:F2、F7、F9、COLEC11、APOC2、FBLN5、MTTP、MST1、VCAM1。早期低表达,晚期高表达且>1.5倍表达蛋白共12个。我们对早期205个差异表达蛋白进行蛋白质-蛋白质互作分析,找出了 10个互作关键蛋白。此外,我们在动物模型的蛋白组学结果中最终选取20个候选蛋白,在20例术后脓毒症患者和21例非脓毒症患者进行靶向蛋白组学验证,利用t-test验证(p<0.05)证实Sepsis上调蛋白有:LBP,C1R,VWF,VCAM1,CFI,PLTP,CRP,SERPINA3,SERPIND1 下调蛋白有:FN1,CLU,THBS1,LCAT,ITIH1。我们一一进行ROC曲线分析,来判别每个蛋白单独作为标志物用于诊断脓毒症的能力。我们一共发现9个ROC-AUC超过0.7的潜在标志物可供下一步进行多因素logistic回归诊断模型的建模。最终的logistic回归模型含有三个蛋白,分别是 Lipopolysaccharide-binding protein(LBP),Clusterin(CLU)和 Vascular cell adhesion protein 1(VCAM1)。该模型诊断阈值为0.5,ROC曲线下面积达0.921(95%CI:0.837～1.000),敏感度达到85.0%,特异性达到90.5%。结论:本次尿源性脓毒性休克动物(兔)模型的蛋白质组学研究发现,实验组和对照组相比,三个时间点比较中变化趋势均一致(都上调或都下调)的有6个差异表达的蛋白;早期表达有差异,晚期表达无差异且>1.5倍表达的有9个差异表达的蛋白;早期低表达,晚期高表达且>1.5倍表达的有12个差异表达的蛋白;通过软件分析整个网络并从205个早期表达差异的蛋白中筛选出前10个关键蛋白。上述这些差异表达的蛋白都可能与尿源性脓毒性休克密切相关,有望成为尿源性脓毒性休克早期诊断的新指标。最后,通过靶向蛋白质组学在临床脓毒症患者血清样本中进行验证,运用ROC曲线和多因素logistic回归分析最终筛选出了 3个具有早期诊断价值的差异蛋白并建立了具有较高敏感性和特异性的诊断模型。