猪胰腺脂肪酶(PPL)是一种由449个氨基酸组成的单链球蛋白,分子大小在50-52kDa。猪胰腺脂肪酶作为一种内源性的脂肪酶,能高效的将甘油三酯水解并释放脂肪酸。在动物机体内,饲粮中脂肪的消化吸收主要依赖于胰腺酶类。脂肪的消化对动物特别对能量要求极高的仔猪具有重要意义,因为仔猪从饲粮中获得的能量有时不能满足自身的需求,需要动用机体沉积的脂肪来满足能量需求。在仔猪断奶期间,胰腺消化酶的激活、分泌和功能尚未发育完善,特别是一些主要分解类的酶如脂肪酶。在幼龄阶段尤其是断奶期间,PPL分泌不足会导致仔猪应激,造成生长停顿或迟缓,造成重大的经济损失。商品的猪胰腺脂肪酶常用于帮助患有胰腺功能紊乱和营养不良的病人,帮助病人消化。但是商品猪胰腺脂肪酶主要来源于动物胰腺提取,在提取过程中会有一些其他酶类的污染。在生产过程中酶蛋白的提取和纯化的高成本、猪胰腺组织资源有限、潜在的微生物疾病污染等因素限制了猪胰腺脂肪酶在饲料工业中的大规模生产应用。因此,有必要开发一种利用基因工程重组技术在酵母表达系统中高效、安全表达具有天然生物学活性猪胰腺脂肪酶的方法。本研究的目的是通过对猪胰腺脂肪酶(PPL)部分基因进行密码子优化,然后在毕赤酵母真核表达系统进行高效表达后,对重组蛋白进行纯化,然后进行酶学活性的分析。首先根据毕赤酵母密码子偏好性,人工设计并合成一段534 bp的PPL蛋白N端氨基酸(不含信号肽)编码序列(oPPL),然后将该片段与剩余天然PPL编码基因序列片段进行连接,获得全长PPL编码序列(rePPL),将rePPL基因片段克隆到pPICZaA表达载体,构建pPICZaA-rePPL表达载体；将构建好的表达载体转化入毕赤酵母X-33宿主菌中,通过甲醇对转化子进行诱导表达,实现重组蛋白PPL在毕赤酵母真核表达系统中的高效表达。重组外源PPL蛋白C端含有His标签,通过亲和层析(利用Ni Sepharose High Performance层析柱)对表达蛋白进行纯化,然后对重组蛋白rePPL进行酶学活性分析并与来源于猪胰腺提取的天然商品胰腺脂肪酶PPL(Sigma)进行酶学特性比较。表达纯化后的重组rePPL在12% SDS-PAGE检测显示蛋白质分子量为52 kDa,酶学性质分析显示重组PPL与天然商品PPL具有相似的酶学特性,其最适温度为40℃,最适pH为8.0,Km值为15.4 mg/mL, Vmax为432U/mg。热稳定性结果显示重组PPL不耐热,在60℃保温20 mm后,酶活力失去80%(P<0.05)。通过密码优化可以显著提高重组rePPL表达量,与没有密码子优化的PPL转化子菌株相比,表达量提高了近3倍(146 mg/L vs 36 mg/L),总酶活提高了约4倍(1900 IU/L vs 346.7IU/L)。金属离子实验表明,Ca2+、Zn2+、Cu2+和Fe3+均显著抑制重组rePPL和商品猪胰腺脂肪酶活性,并呈现出剂量有依赖性效应。本实验根据毕赤酵母密码子偏好性对猪胰腺脂肪酶编码基因进行部分密码子优化,成功地获得高表达、具有天然酶活性的重组猪胰腺脂肪酶。