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从肝细胞感染肝炎病毒获得病毒基因这一角度来讲,病毒性肝炎可以看作是一种获得性单基因遗传病。因此,基因治疗是可供选择的治疗手段之一。对治疗性乙肝疫苗的深入研究有望打破机体免疫耐受状态并最终清除病毒。近年来,有研究报道,将CD40L与肿瘤抗原融合表达,能够通过CD40L的靶向作用,将肿瘤抗原带到DC表面,进而更加有效发挥抗肿瘤效应。本研究,将构建携带乙肝病毒抗原与CD40L的融合蛋白基因及GM-CSF基因的pUDK载体,并于体内外对其免疫激活作用及病毒清除功能进行研究,希望为乙肝疫苗的研究提供一种新的思路。首先,采用基因合成方法分别得到了目的基因IL=2信号肽、通用辅助性T细胞肽段(T helper lymphocyte,HTL) PADRE、CTL肽段HBcAg18-27、PreS B肽段以及含有异亮氨酸拉链(isoleucine zipper,IZ)区的接头；通过PCR方法得到小鼠CD40L分子；采用PCR连接方法将其顺序连接得到融合蛋白基因HBV-IZ-mCD40L (HmL)。将融合蛋白基因与GM-CSF基因克隆到质粒载体pUDK上,获得重组质粒pUDK-HmL-IR-GM。将其转染细胞,通过Western blot、ELISA等方法,在蛋白水平证实外源基因可以正确表达。其次,我们用重组质粒pUDK-HmL-IR-GM免疫正常Balb/c小鼠,通过检测抗体诱生来评价体液免疫的激活；通过FACS检测T淋巴细胞的亚群变化、利用MTT法检测增殖能力、通过乳酸脱氢酶释放法检测杀伤作用、通过ELISA法检测细胞因子诱生等,来评价细胞免疫的激活；另外,我们还初步探讨了该治疗性疫苗的作用机理。结果显示,与pUDK对照组相比,pUDK-HmL-IR-GM免疫能成功诱导正常小鼠体液免疫,刺激CD4+T淋巴细胞增值,极化TH1型细胞因子产生。最后,我们用重组质粒pUDK-HmL-IR-GM对HBV转基因小鼠(HBVTg)进行治疗,通过观察免疫后HBV Tg小鼠的病毒滴度、抗原抗体变化、对细胞免疫功能的影响以及肝脏病理组织的变化判断其疗效。结果显示：虽然在转基因鼠上没有明显降低病毒滴度的作用,但HBVTg小鼠血清HBeAg水平可因治疗型HBV基因疫苗的治疗而呈现下降趋势；同时,肝组织HE染色显示实验组小鼠肝组织可见明显的淋巴细胞浸润和少量的肝细胞肿大及玻璃样变性,提示该治疗性疫苗激发了细胞免疫应答,部分打破免疫耐受。其作用的发挥可能是通过诱导细胞免疫,极化TH1型细胞应答来实现的。我们成功构建了携带HBV多表位抗原肽、mCD40L及GM-CSF的重组质粒,该质粒能刺激正常和HBV转基因小鼠产生体液和细胞免疫应答,可部分打破小鼠机体的免疫耐受状态,为HBV持续感染的特异性免疫治疗制品的设计提供理论与实践依据。