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实验目的：人体内红细胞生成(erythropoiesis)是一个受体内02的调节而产生红细胞的复杂过程。在成年人的体内,红细胞是在骨髓中生成的,但是在早期的胚胎中,红细胞是在卵黄囊的中胚层细胞中生成的。随着老龄化社会的到来,对于血液的需求量不断的增大,血源变的紧张。另外,病原微生物和疾病的传播等问题也给血液临床应用的安全性和广泛性带来了很大的挑战。因此,人们期望找到更为安全、经济和有效的血细胞和造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)的资源。虽然有研究者也对其它可大量生成红细胞的HSCs进行了研究,如脐带血、骨髓以及外周血,但由于受到研究材料的限制,红细胞的早期分化机理还有待进一步的研究。人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)向造血干／祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cells, HSCs/HPCs)分化以及向红细胞方向的分化己有报道,但是这些研究大多利用了饲养层共培养体系或动物源血清,从而引入了可能影响分化的外源性调节因子。本研究拟通过利用人诱导多潜能干细胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)和hESCs可以体外扩增从而不断提供细胞材料这一特性,建立无饲养层细胞、无血清的定向诱导造血分化体系,进而深入地研究人多潜能干细胞(human pluripotent stem cells, hPSCs)来源的HSCs/HPCs在化学成分明确的培养条件下定向诱导红细胞分化以及TGF-β信号通路在这一分化过程中的调节作用,为将来解决临床病人红细胞血源问题探索技术途径。实验方法：为了明确不同生长因子对hPSCs定向诱导造血分化的影响,我们需要建立hPSCs无饲养层、无血清的造血诱导分化体系来进行开展研究。无饲养层细胞的诱导分化体系能够排除由于饲养层细胞分泌的未知细胞因子对造血分化的影响,同时还可以排除饲养层细胞与待诱导分化细胞之间的相互作用以及细胞外基质与分化细胞之间相互作用对造血分化的影响；无血清分化体系则排除了未知外源生长因子的影响,从而克服了传统的共培养体系不能精确的反映不同生长因子对造血分化影响的困难。首先,hESCs和hiPSCs采用常规的hESCs培养方法培养,即hPSCs培养在丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维饲养层细胞上,每天更换新鲜hESC培养基。然后,将培养的多潜能干细胞克隆消化并制备成单细胞悬液,采用悬滴法形成拟胚体(Embryoid Body, EB),2天后收集形成的EBs并继续进行悬浮培养,诱导造血分化。经过8天左右的造血诱导分化后,EBs消化成单细胞并标记上特异性抗CD34单克隆抗体进行流式细胞分析,利用磁珠分选(MACS)的方法将HSCs/HPCs分选出来,经流式细胞检测进一步鉴定CD34+ HSCs/HPCs的纯度。最后,将分选获得的高纯度CD34+干祖细胞进行红细胞的诱导分化。在造血分化的过程中进行流式细胞检测、CFC (colony-forming cell assay)、Wright-Geimsa染色、激光共聚焦显微镜检验鉴定造血分化各阶段的细胞分化状态；利用RT-PCR、实时定量PCR检测各分化阶段的血红蛋白的表达情况；分光光度计检测分析细胞内G6PD酶活性。此外,为研究TGF-β信号通路在诱导红细胞分化过程中的调节作用机制以及细胞外基质与分化细胞的相互作用,我们分别利用BrdU和TNEL方法检测了造血祖细胞在TGF-β以及其抑制剂调节作用下的细胞增殖周期和细胞凋亡。实验结果：我们克服了hPSCs的单细胞悬液无法形成EB的困难,使得EB的形成效率达到90%以上。形成的EBs经不同组合细胞因子定向诱导分化为HSCs/HPCs,流式细胞分析检测表明CD34+ HSCs/HPCs所占比例平均为15%。分化的CD34+HSCs/HPCs经磁珠分选的方法分选纯化后在无饲养层细胞、无血清条件下定向诱导红细胞分化。hPSCs来源的CD34+HSCs/HPCs在细胞外基质包被的培养板中首先贴壁存活生长,培养2天后可观察到半贴壁细胞的出现,随着半贴壁细胞的增多而逐渐形成一些半贴壁细胞集落。培养6天后培养孔中可观察到较多的悬浮细胞,流式细胞分析检测表明,80±5%以上的细胞为CD71 high细胞,并且随着体外诱导分化培养时间的延长,细胞核逐渐固缩变小,细胞也逐渐变小,血红蛋白表达水平逐渐提高,Wright-Giemsa染色表明细胞为红系细胞；诱导培养10-15天的细胞经免疫荧光标记后在共聚焦显微镜镜下可观察到无核的CD235a+/CD71+细胞的存在。同时我们检测了不同造血生长因子对CD34+造血祖细胞谱系分化的影响,并发现促红细胞生成素(erythroipoitin, EPO)信号通路对红细胞的分化起主导作用；EPO除了可以显著提高CD71+/CD235a+细胞数目,而且还提高了血红蛋白的表达。而TGF-β (transforming growth factor β)在EPO和其它造血生长因子存在的条件下显著性的减少了悬浮细胞的数目以及BFU-E的数目,然而CD71+细胞的百分率并没有变化。我们的研究表明EPO信号通路和抑制TGF-β信号通路可协同促进红系祖细胞的增殖。TGF-β对早期的干祖细胞的增殖有抑制效应,而对晚期较成熟的红系细胞增殖没有影响。然而,早期干祖细胞所处分化阶段的不同,TGF-β所发挥的生物学效应也不一样；对于早期的造血祖细胞,TGF-β通过诱导细胞凋亡,进而抑制了祖细胞增殖；而对于红系祖细胞TGF-β有促进其分化发育为成熟细胞的作用,从而间接抑制了红系祖细胞的分裂增殖,现象上表现为TGF-β抑制红系祖细胞数目的增多。结论：本课题建立了无饲养层、无血清的hPSCs来源红系祖细胞诱导分化体系。我们的研究表明,在这一分化体系里EPO信号通路和抑制TGF-β信号通路可协同促进红系祖细胞的增殖。TGF-β对早期的干祖细胞的增殖有抑制效应,但其促进红系祖细胞发育成熟。这为TGF-β在将来生产临床应用红细胞时发挥调节作用提供了科学依据。