论文部分内容阅读
异黄酮属植物酚类物质,是苯丙烷类的次级代谢产物之一,对人体具有广泛的生理调节功能。植物中异黄酮的合成受环境因素调控,其中光诱导作用广受关注,并以中波紫外光(UV-B)作用最强。然而,UV-B胁迫本身不能直接参与次级代谢产物的累积,而需由内源信号分子介导。本文从信号转导的角度探讨了 UV-B胁迫富集大豆芽菜中异黄酮的机制。1、研究了 UV-B胁迫下脱落酸(Abscisicacid,ABA)对异黄酮积累的诱导作用。大豆籽粒发芽期间,UV-B胁迫通过激活9-顺环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,NCED)以促进 ABA 合成。UV-B 辐照和外源 ABA处理下内源ABA含量显著提高,第4天达到最大值,分别为对照的1.9和2.4倍;同时,UV-B胁迫和ABA处理亦促进了异黄酮含量的显著增加,第4天达到最大值,分别为对照的1.5和1.4倍;两者联合处理具有叠加效应,表明ABA可能参与了 UV-B胁迫下大豆芽菜中异黄酮的累积。2、研究了 UV-B胁迫下一氧化氮(Nitric oxide,NO)对异黄酮积累的诱导作用。UV-B处理使NO含量显著提高,发芽第2天达到最高值,为对照的5.8倍,此为一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)活性的提高所致。NO淬灭剂羧基-2-苯-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline,cPTIO)抑制了 UV-B胁迫下大豆茅菜中NO的合成,且此淬灭效果可被外源NO供体硝普钠(Sodiumnitroprusside,SNP)逆转,表明UV-B胁迫诱导了大豆芽菜中NO的合成。同时,cPTIO使UV-B胁迫下大豆茅菜中异黄酮含量降低了 32%,查尔酮合酶(Chalcone synthase,CHS)和异黄酮合酶(Isoflavone synthase,IFS)活性降低了 42%和 26%,CHS和IFS表达量降低了 23%和43%,且此抑制效果可被外源NO供体SNP所逆转。SNP单独处理亦可富集异黄酮。可见,NO是UV-B胁迫下大豆芽菜中异黄酮积累的必要信号分子。3、研究了 UV-B胁迫下ABA和NO之间的互作。发芽4 d时,UV-B胁迫和ABA处理下,NO含量为对照的5.1和6.3倍,NOS活性为对照的2.7和2.8倍;此外两者联合处理具有叠加效应。由此推测,ABA可能参与了 UV-B胁迫对NO合成的诱导作用。发芽4 d时,cPTIO使UV-B胁迫下ABA含量、NCED活性及其基因表达量分别降低了 26%、28%和41%,此抑制作用可被SNP逆转。SNP单独处理亦可促进ABA的合成。此外,NO可调控ABA发挥信号转导作用所需的核心组分蔗糖非酵解型蛋白激酶(SNF1-related protein kinase,SnRK)和蛋白磷酸(Type 2C protein phosphatase,PP2C)的蛋白表达。因此,UV-B胁迫下ABA和NO之间存在互作。4、研究了环鸟苷酸/蛋白激酶 G(Guanosine 3’,5’-cyclic phosphate/Protein kinase G,cGMP/PKG)途径作为ABA和NO的下游信号介导UV-B胁迫诱导大豆异黄酮合成的作用。大豆籽粒发芽期间,UV-B胁迫显著促进了 cGMP含量和鸟苷酸环化酶(Guanylyl cyclase,GC)活性及其蛋白表达量的提高,第4天达到最大值,为对照的2.4、2.3 和 1.2 倍。发芽 4d 时,6-苯胺-5,8-喹啉苯醌(6-Anilino-5,8-quinolinequinone,LY83583)(GC抑制剂)使UV-B胁迫下cGMP含量和GC活性及其蛋白表达量下降了 52%、27%和16%,ABA、SNP 和 8-Br-cGMP 均可逆转此抑制作用。ABA、SNP和8-Br-cGMP单独处理可显著提高cGMP含量。ABA和SNP单独处理下,GC活性及其蛋白表达量亦得以显著上调。因此,UV-B胁迫下ABA和NO通过激活GC促进了 cGMP的合成。发芽4d时,LY83583和KT5823(PKG抑制剂)使异黄酮合成量降低了 37%和24%、CHS活性降低了 40%和39%、IFS活性降低了 24%和25%、CHS基因表达量降低了 18%和29%、IFS基因表达量降低了 41%和32%、CHS蛋白表达量降低了 56%和59%、IFS蛋白表达量降低了 86%和78%。ABA、SNP和8-Br-cGMP可逆转上述的抑制作用。ABA、SNP和8-Br-cGMP处理本身亦可促进异黄酮合成量及其合成关键酶活性与表达量的增加。因此,GC/cGMP通过依赖PKG的途径作为ABA和NO的第二信使调控了异黄酮的积累。5、研究了肌醇三磷酸(Inositol 1,4,5-trisphosphate,IP3)作为 cGMP/PKG 的次级信号进一步传递ABA和NO信号来诱导UV-B胁迫下异黄酮合成的作用。大豆发芽期间,UV-B胁迫显著增加了 IP3含量和特异性磷脂酶C(Phosphoinositide-specific phospholipase C,PI-PLC)活性、基因及蛋白表达量,于第4天达到最大值,分别为对照的 2.5、2.5、3.3 和 2.1 倍。发芽 4d 时,LY83583 和 KT5823 使 UV-B 胁迫下 IP3含量和PI-PLC活性、基因及蛋白表达量均降低。ABA、SNP和8-Br-cGMP可逆转此抑制作用。ABA、SNP和8-Br-cGMP单独处理亦可显著上调IP3含量和PI-PLC活性、基因及蛋白表达量。因此,UV-B胁迫下ABA和NO诱发的cGMP/PKG通过激活PI-PLC,从而促进了 IP3的积累。发芽4 d时,PI-PLC抑制剂新霉素,使UV-B胁迫下异黄酮含量下降了 32%、CHS和IFS的活性下降了 46%和53%、CHS和IFS的基因表达量下降了 55%和36%、CHS和IFS蛋白表达量下降了 67%和69%,ABA、SNP和8-Br-cGMP可逆转上述抑制效果。因此,IP3作为cGMP/PKG的下游信使介导了UV-B胁迫下异黄酮的积累。6、研究了环腺苷二磷酸核糖(cADP-ribose,cADPR)作为cGMP/PKG的次级信号进一步传递ABA和NO信号来诱导UV-B胁迫下异黄酮合成的作用。大豆籽粒发茅期间,UV-B胁迫处理显著诱导了 cADPR含量和腺苷二磷酸核糖环化酶(ADP-ribosylcyclase,ADPRC)活性及其蛋白表达量的增加,于第4天达到最大值,分别为对照的2.9、1.8和1.8倍。发芽4 d时,LY83583和KT5823使cADPR含量,ADPRC活性和蛋白表达量均显著下降。ABA、SNP和8-Br-cGMP可逆转此抑制效果。ABA、SNP和8-Br-cGMP处理本身亦可促进cADPR含量和ADPRC活性及其蛋白表达量的增加。因此,UV-B胁迫下GC/cGMP/PKG激活了 ADPRC,从而促进cADPR的合成。发芽4d时,cADPR抑制剂烟酰胺使UV-B胁迫下异黄酮含量降低了 41%,CHS和IFS的活性降低了 32%和44%,CHS和IFS的基因表达量降低了 22%和23%,CHS和IFS的蛋白表达量降低了 36%和38%,ABA、SNP和8-Br-cGMP可逆转上述的抑制效果。因此,cADPR作为cGMP/PKG的下游信使介导了 UV-B胁迫下异黄酮的积累。7、研究了促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)作为cGMP/PKG的次级信号进一步传递ABA和NO信号来诱导UV-B胁迫下异黄酮合成的作用。UV-B胁迫下,MAPK表达量于第4天达到最大值,为对照的1.8倍。发茅4 d 时,LY83583 和 KT5823使M P 表达量下降了 2 1%和 20%。ABA、SNP 和 8-Br-cGMP处理可逆转此抑制效果。ABA、SNP和8-Br-cGMP单独处理亦可上调MAPK的表达量。因此,GC/cGMP/PKG增强了 UV-B胁迫下MAPK的表达。发芽4 d时,MAPK抑制剂U0126使UV-B胁迫下异黄酮含量及CHS和IFS的表达量下降了 25%、19%和31%,ABA、SNP和8-Br-cGMP处理可逆转上述的抑制效果。因此,MAPK作为cGMP/PKG的下游信使介导了 UV-B胁迫下异黄酮的积累。8、研究了 Ca2+在UV-B胁迫诱导异黄酮合成的作用。大豆籽粒发芽4d时,Ca2+螯合剂乙二醇二乙醚二胺四乙酸(Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid,EGTA)使异黄酮含量抑制了 59%、CHS和IFS的活性抑制了 47%和24%、CHS和IFS的基因表达量抑制了 44%和43%、CHS和IFS蛋白表达量抑制了 18%和27%。因此,Ca2+可能参与了 UV-B胁迫对异黄酮合成的诱导作用。