论文部分内容阅读
硒是哺乳动物不可缺少的一种微量元素,硒在防治肿瘤、心血管疾病、抗病毒感染、皮肤病和调节甲状腺、免疫与生殖功能上具有重要作用。硒蛋白是一类硒代半胱氨酸(Sec)以终止密码子之一的UGA介导插入到蛋白质氨基酸序列当中形成的特殊蛋白质。业已证明人硒蛋白SelK定位于细胞内质网,但其生物学功能有待进一步阐明,对人硒蛋白SelK的功能研究具有重要的理论意义和医学价值。前期研究已经证明果蝇硒蛋白dSelK具有诱导人胃癌823细胞凋亡的生物学功能,其凋亡的机理是果蝇硒蛋白dSelK的过表达造成位于内质网上的inositol (1,4,5)-trisphosphate receptor(IP3 receptor)表达量的升高,造成内质网中钙离子向细胞浆中释放量的升高,引起细胞生物学功能产生紊乱。人硒蛋白SelK是果蝇硒蛋白dSelK的同源基因,对其生物学功能的研究对于阐明人硒蛋白SelK在人体生长发育中的重要作用及一些疾病的发病机理具有更为重要的作用。本文通过构建人硒蛋白SelK在人体细胞中的表达质粒p-SelK-Dsred2,转染胃癌BGC-823细胞,用钙离子荧光探针检测转染后细胞钙离子浓度变化,通过Hoechst33342染色和Tunel实验检测细胞凋亡,证明硒蛋白SelK是否诱导凋亡,以及细胞凋亡和钙离子浓度变化的关系。首先,构建人硒蛋白SelK的人体表达质粒p-SelK-Dsred2,及阴性对照内质网蛋白ERp29的人体表达质粒p-ERp29-Dsred2。通过脂质体转染的方法,将p-SelK-Dsred2和p-ERp29-Dsred2分别转染到人胃癌细胞BGC-823中。对细胞浆内的游离钙离子利用荧光探针Fluo-3/AM进行染色,通过激光共聚焦显微镜及钙离子荧光强度分析软件比较转染前后细胞浆中游离钙离子浓度的变化。结果显示,在人硒蛋白SelK过表达后人胃癌细胞BGC-823细胞浆中的钙离子浓度升高了3.27倍,与非转染的空白对照组相比差异极显著(P<0.01)。而在转染p-ERp29-Dsred2后人胃癌细胞BGC-823细胞浆中的游离钙离子与空白对照组相比差异不显著(P>0.05)。说明人硒蛋白SelK的过表达可以使细胞浆内游离钙离子浓度发生显著升高。然后,对转染p-SelK-Dsred2 p-ERp29-Dsred2两种质粒的人胃癌细胞BGC-823,利用Hoechst33342染色、Tunel实验和激光共聚焦显微镜检测其诱导细胞凋亡的情况。结果表明人硒蛋白SelK具有诱导人胃癌823细胞凋亡的功能,而阴性对照ERp29则无诱导凋亡作用,说明人硒蛋白SelK的过表达具有诱导癌细胞凋亡的作用。综上所述,人硒蛋白SelK具有诱导人胃癌823细胞凋亡的功能,诱导凋亡的主要原因是SelK的过表达造成细胞浆内钙离子浓度的显著升高。上述研究为系统阐明人硒蛋白的生物功能打下良好基础。