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Kallistatin(KAL)是一种多功能蛋白,具有抗氧化应激、抗血管生成、抗纤维化、抗肿瘤等多种活性。本实验室前期运用酵母工程菌发酵并制得其重组蛋白,用于制备其单克隆抗体时发现效价不高,分析可能由于酵母菌表达重组KAL蛋白的分子构象发生变化而致。于是本文主要构建CHO-K1细胞高表达载体,并筛选高表达KAL蛋白的稳定株,悬浮无血清驯化后,批量表达纯化得到KAL蛋白并探索其对肝癌的作用。本文主要的研究方法和研究结果如下:首先运用基因工程技术构建了含有Kozak序列,人白蛋白信号肽与人工设计的信号肽,穿膜肽TAT与pcDNA3.1、pTT5、pMH3、pMH3EN载体相连的18种载体。用PEI瞬时转染,双抗夹心ELISA检测,选取KAL表达量最高的载体,运用优化的转染条件转染CHO-K1细胞,转染后36 h,消化转移至培养皿中,用筛选浓度G418来筛选,挑取单菌落接种到96孔细胞培养板中,G418继续筛选。7天后ELISA检测细胞上清KAL含量,选取阳性值高(A≥1.0),有限稀释法克隆化。经三次克隆化后,逐渐扩大培养置100 mm细胞培养皿中,成功筛得表达KAL的稳定株。然后悬浮无血清驯化后,批量表达优化,Ni柱纯化得到KAL蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot鉴定之。最后用CCK-8和Hoechst 33342染色以及Transwell实验分别检测KAL对肝癌细胞的作用,并用Western blot初步验证KAL对肝癌的可能原因。本研究表明:(1)不同信号肽,穿膜肽对蛋白的分泌表达效果不尽相同,其中本研究使用的一种人工设计的信号肽对KAL的表达量在不同载体都有显著提高。本研究构建的最佳载体是未优化载体的KAL表达量的10倍。(2)运用G418筛选,三次克隆化后成功筛选出表达KAL的CHO-K1的4株稳定株——2F8、4B4、4E7和7D11。悬浮无血清驯化后,继续加维持剂量的G418和采用分次流加培养的方法,10天时培养基中KAL蛋白浓度最高为11mg/L。批量表达Ni柱纯化CHO细胞表达的KAL重组蛋白分子量为60 kD左右,比大肠杆菌(40 kD)和酵母(58 kD)表达的要略大。主要因为CHO细胞翻译后修饰以及有His标签。(3)研究发现KAL能抑制肝癌细胞的生长增殖,Tranwell实验表明KAL可抑制其迁移和侵袭。Hoechst33343染色发现其可诱导肝癌细胞凋亡,其诱导肝癌凋亡的具体机制有待进一步研究。