目的:　　 早产儿视网膜病变(ROP)是一种眼部血管增殖性病变,随着早产儿治疗成活率的提高,ROP成为婴幼儿致盲的重要原因,给患儿和家属带来巨大的痛苦和经济负担,尽管近年来通过严格控制用氧,ROP的发生率、严重程度和阈值病变有所减少,但对于极低出生体重儿仍十分常见。ROP的确切病因尚未明确,目前研究认为ROP的发生与“相对缺氧”有关。大量的研究显示,视网膜新生血管形成在ROP的发病过程中起主导作用,而新生血管形成是一个极其复杂的病理生理过程,其间受多种因子的调节,除血管内皮生长因子(VEGF)外,DⅡ4基因是另一个可因半剂量等位基因缺失导致血管构建异常而使动物在胚胎期死亡的基因,DⅡ4是Notch信号通路的一种配体,在多种组织和器官的生理及病理性血管生成中特异性表达。Notch信号通路广泛存在于脊椎动物体内,进化上高度保守,参与调控多种器官、组织的发育和细胞分化过程。研究发现,Notch信号通路在视网膜细胞发育分化及视网膜血管发生的生理及病理过程中亦起重要作用,然而,Notch信号通路在视网膜新生血管形成过程中的具体作用机制目前还不清楚,研究显示VEGF和Notch信号传递途径(Notchsignalingpathway)参与诱导和挑选尖端细胞的过程,其中,相临细胞间Delta样配体4(DⅡ4)激活Noch信号在血管新生过程中起着关键性的作用,DⅡ4是目前发现的Notch通路中最有应用潜力的抗新生血管靶点,已知VEGF和DⅡ4-Notch信号通路之间存在一定联系,但二者之间相互作用的具体环节及机制尚待阐明。抗VEGF治疗是目前临床上唯一被认可用于眼内新生血管性疾病治疗的血管调控因子,关于DⅡ4-Notch信号的研究将为眼底新生血管疾病的防治提供新的途径。在本研究中,我们构建大鼠OIR模型模拟早产儿视网膜病变,通过对大鼠OIR模型中DⅡ4及其受体Notch1的表达情况进行检测,观察DⅡ4-Notch信号通路在早产儿视网膜病变模型中的表达变化,探讨DⅡ4-Notch信号通路在调节视网膜新生血管生成中的作用及其临床意义,同时观察在OIR大鼠视网膜中,玻璃体腔给予DⅡ4单克隆抗体后,DⅡ4与VEGF及其相关受体VEGFR-1、VEGFR-2和neuropilin-1(NRP-1)在表达水平的改变及二者的相关性,探讨DⅡ4-Notch信号通路的作用机制,以期为视网膜新生血管生成机制的研究及防治提供新的思路。　　 方法:　　 1、构建高氧诱导大鼠OIR模型。　　 2、HE染色视网膜切片观察视网膜各层结构及计数突破内界膜的血管内皮细胞核数目,并判定造模成功与否。ADP酶视网膜铺片观察视网膜血管形态学改变。　　 3、Western-Blot和PT-PCR技术检测大鼠OIR模型视网膜中DⅡ4及受体Notch1的表达情况。　　 4、HE染色视网膜切片及ADP酶视网膜铺片观察DⅡ4单克隆抗体玻璃体腔注射后,视网膜的形态学改变。　　 5、应用RT-PCR技术检测DⅡ4单克隆抗体玻璃体腔注射后,大鼠OIR模型视网膜中,VEGF及其受体VEOFR-1、VEGFR-2和NRP-1的表达变化。　　 结果:　　 1、成功的构建了高氧诱导大鼠OIR模型。　　 2、在大鼠OIR模型中,生后第12d即大鼠刚出氧箱时,视网膜血管普遍收缩闭塞,视网膜后极部及中周部出现大片无血管区。回到空气中饲养5d后,后极部视网膜血管扩张、迂曲,在视盘中周部存在无血管区,在有血管区和无血管区的交界处可见新生血管形成。新生血管分布为1～3个钟点。　　 3、在大鼠OIR模型视网膜中,DⅡ4圾Notch1的表达在第12d时,即高氧状态下表达减少,17d即相对低氧时表达增加。同时,在正常大鼠视网膜DⅡ4及Notch1的表达随着视网膜血管发育的成熟而随时间逐渐减少。　　 4、玻璃体腔注射DⅡ4单抗后,OIR大鼠视网膜新生血管严重程度较阴性对照组明显增加,可见大量突破内界膜的血管内皮细胞,新生血管分布为4～8个钟点。　　 5、玻璃体腔注射DⅡ4单抗后,OIR大鼠视网膜中VEGF、VEGFR-1和VEGFR-2的表达水平无显著变化,而NRP-1表达显著上调。　　 讨论　　 早产儿视网膜病变,是一种视网膜发育过程中的纤维血管增殖失调。ROP的主要危险因素为低孕龄和低出生体重。ROP的自然病程将最终导致失明,并带来沉重的社会负担和经济负担。不可逆的视力下降将阻碍患儿的认知和心理的正常发展。ROP的发病机制是多因素并且复杂的。ROP的主要病理改变是低氧诱导的视网膜新生血管发生。研究显示缺氧时DⅡ4-Notch信号通路和VEGF在新生血管过程中的重要介质。DⅡ4作为内皮特异的Notch配体在病理和生理血管生成过程中发挥调节作用。同时,与VEGF相似,DⅡ4单倍不足将引起严重血管缺陷从而导致小鼠胚胎死亡。虽然近期有许多研究进展,但DⅡ4和ROP之间的作用仍然需要进一步的研究探索。　　 本研究建立的大鼠模型,其视网膜血管形态与病理组织结构改变两方面都与人类ROP病变相似,成为研究ROP发病机制及治疗对策的基础。我们观察到,大鼠在高氧环境饲养时,视网膜血管广泛收缩闭塞,后极部产生大量的无血管区。返回空气中,即处于相对低氧环境后,大量的无血管区加重视网膜缺氧,诱导视网膜新生血管产生。随着氧浓度的改变,DⅡ4、Notch1的表达也随之改变。高氧时DⅡ4、Notch1表达明显减少,而缺氧时,DⅡ4、Notch1表达显著增加。这一变化趋势与VEGF的变化一致[21,22],低氧诱导VEGF及DⅡ4和Notch1表达的上调,提示DⅡ4-Notch通路在早产儿视网膜病变的发病过程中起重要作用,DⅡ4-Notch通路可能参与了VEGF调控视网膜新生血管生成的过程。　　 研究显示,在生理及病理状态下新生血管生成时DⅡ4-Notch信号的激活,对血管内皮细胞增生、分化和萌芽等生物学行为具有调控作用[23,24]。本研究中我们也观察到新生大鼠视网膜的正常发育过程中DⅡ4和Notch1中等程度表达,随着视网膜血管的发育成熟DⅡ4和Notch1的表达逐渐减少,与之前的研究一致,说明在视网膜的发育成熟过程中DⅡ4参与调节血管的发生。　　 研究显示,抑制DⅡ4-Notch信号将导致血管萌发和分支增加,但新生的血管功能不良。在我们的实验中,大鼠玻璃体腔注射DⅡ4单抗抑制DⅡ4的表达后,同样观察到OIR大鼠视网膜新生血管增多及血管密度增加。提示,DⅡ4-Notch信号通路在视网膜病理性血管新生过程中可能发挥抑制新生血管过度生成的作用,推测DⅡ4对OIR大鼠的视网膜具有一定的保护作用。　　 目前的研究认为,VEGF对DⅡ4-Notch信号通路存在正调节作用,血管的生长和发育在Notch信号通路与VEGF共同构成的反馈环路中受到精细调控。此外,VEGF和DⅡ4.的协同作用参与肿瘤和其他新生血管疾病的发病过程。前者促进后者的表达,而后者则表现为对前者的负性调控。在本实验中,我们使用高氧诱导的大鼠早产儿视网膜病变模型,观察到DⅡ4单克隆抗体玻璃体腔注射可以有效的抑制DⅡ4的表达,DⅡ4表达的下调导致了视网膜新生血管的增加,ROP病变程度的加重,但VEGF及其受体VEGFR-1的表达无明显改变,虽然VEGFR-2的表达较对照组略升高,但与阴性对照组比较无统计学意义,而NRP-1mRNA的表达水平却显著升高,因此推测,在体内DⅡ4-Notch信号通路在ROP的发病过程中可能通过反馈调节VEGF受体来抑制病理性血管的生成。　　 上述结果提示DⅡ4在早产儿视网膜病变的发病过程中起重要作用,DⅡ4参与了视网膜新生血管的发生,DⅡ4可能作为一种抑制视网膜新生血管的潜在保护因子起作用,它的发现为视网膜新生血管疾病的治疗提供了新的思路,而DⅡ4的具体作用机制还有待进一步的研究来证实。　　 结论:　　 1、DⅡ4-Notch信号通路参与调节早产儿视网膜病变模型的新生血管形成过程。　　 2、DⅡ4-Notch信号通路在正常视网膜血管发育和病理血管新生的过程中均起重要作用。　　 3、DⅡ4-Notch信号通路受到低氧和VEGF的调控,并可能通过反馈调节VEGF受体发挥抑制病理性新生血管过度形成的作用。