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研究背景： 长QT综合征(LQTS),又称延迟复极综合征,主要的临床表现包括室性心律失常(以尖端扭转性室性心动过速、室颤多见)、晕厥和猝死。根据病因分为先天性或遗传性长QT综合征,以及获得性长QT综合征两大类。其中,获得性长QT综合征常与电解质紊乱、心动过缓、心肌缺血及某些药物等因素相关。由于导致QT间期延长的因素众多,和它本身所具有的潜在致命性,因此越来越受到人们的关注。根据突变基因的不同,LQTS分为12种类型,分别为LQT1至LQT12。12种LQTS的致病基因分别为:KCNQ1(LQT1)、KCNH2(LQT2)、SCN5A(LQT3)、ANK2/AnkyrinB(LQT4)、Mink/KCNE1(LQT5)、MiRP1/KCNE2(LQT6)、KCNJ2(LQT7)、CACNA1/Cav2.1(LQT8)、CAV3(LQT9)、SCN4B(LQT10)、AKAP9/Yotiao(LQT11),SNTA1(LQT12)。其中LQT2为第二常见类型,在中国最常见,主要由人类果蝇相关基因(Human ether-a-go-go-related gene,HERG)的突变所致。HERG基因位于人第7对染色体7q35.36位点。HERG钾通道电流参与构成心肌细胞动作电位3期的主要外向电流,其基因突变可导致钾离子通道数量减少或通道功能减退,从而导致QT间期延长。在我们前期的研究中,发现了非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶12(PTPN12)通过与HERG钾通道相互作用而发挥调控HERG钾通道电流振幅的功能。本课题在既往基础上进一步从酪氨酸磷酸化水平调控这一角度深入研究PTPN12对HERG钾通道调控的机理。 目的： 明确PTPN12对HERG钾通道酪氨酸磷酸化的调控作用以及该作用对HERG钾通道电流特性的影响,为深入阐明LQTS的发病机理及开发治疗该病的新型蛋白质药物提供理论基础及新思路。 方法： 1.应用基因定点突变技术,构建一个联合位点突变的pCDNA3.0-HERG Y327A-Y700A-Y845A质粒,然后基因测序进行验证; 2.免疫共沉淀和蛋白免疫印迹技术:本研究分为4个组: a.转染pCDNA3.1-空载体和pCDNA3.0-空载体的HEK293细胞; b.转染pCDNA3.0-HERG和pCDNA3.1-空载体的HEK293细胞; c.转染pCDNA3.0-HERGY327A-Y700A-Y845A和pCDNA3.1-PTPN12的HEK293细胞; d.转染pCDNA3.0-HERG和pCDNA3.1-PTPN12的HEK293细胞。 用RIPA蛋白裂解液提取转染后的HEK293细胞总蛋白,取等量的细胞总蛋白,一部分直接用PTPN12抗体进行Western Blot分析;另一部分与4G10抗体混合过夜,第二天加入Protein A/G Agarose,振荡2小时后离心沉淀,取沉淀物进行凝胶电泳,再用抗HERG抗体和4G10抗体进行Western Blot分析; 3.应用膜片钳技术,检测不同实验组中HERG钾离子通道的电流振幅变化。 本研究分为4个组: 1.对照组(转染pCDNA3.0-HERG细胞组); 2.PTPN12过表达组(共转染pCDNA3.0-HERG和pCDNA3.1-PTPN12细胞组); 3.PTPN12过表达并PAO干预组(共转染pCDNA3.0-HERG和pCDNA3.1-PTPN12,并给予磷酸酯酶抑制剂(sodium orthovanadate,PAO)处理细胞组); 4.PTPN12过表达并HERG突变组(共转染pCDNA3.0-HERGY327A-Y700A-Y845A和pCDNA3.1-PTPN12,的HEK293细胞组)。 结果： 1.成功构建了HERG不同位点的联合突变体,并经DNA测序证明突变位点的存在; 2.免疫共沉淀和蛋白免疫印迹分析发现:相对于HERG单独转染组,PTPN12与HERG共转染组的HERG钾通道酪氨酸磷酸化水平下降2.2倍,PTPN12与HERG突变体共转染组的HERG钾通道酪氨酸磷酸化水平下降3.7倍。 3.膜片钳检测发现,PTPN12过表达组的HERG电流振幅(204.08±17.73pA)明显低于对照组的HERG电流振幅(399.70±29.58pA),两组之间的电流振幅差异具有显著性差异(P<0.010);PTPN12过表达并PAO干预组的电流振幅(414.33±26.67pA)明显高于PTPN12过表达组的HERG电流振幅(204.08±17.73pA),两组的电流振幅差异具有显著性差异(P<0.010);PTPN12过表达并HERG突变组的电流振幅(374.25±22.37pA)明显高于PTPN12过表达组的HERG电流振幅(204.08±17.73pA),两组振幅之间的差异具有显著性差异(P<0.010)。 结论： 1.蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型12对心脏HERG钾离子通道的酪氨酸残基具有去磷酸化作用,对心脏HERG钾通道磷酸化水平具有调控作用; 2.蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型12对HERG钾通道电流振幅具有负性调控作用,其机理可能是通过改变HERG钾通道磷酸化水平实现的; 3.本研究的初步发现将为深入阐明LQTS的发病机理及开发治疗该病的新型蛋白质药物提供理论基础及新思路。