论文部分内容阅读
研究背景及目的白血病居小儿恶性肿瘤发病和死亡的首位。目前在中国有200多万的白血病患儿,且新发病例在不断增加。虽然近年来不断优化治疗方案,但仍有部分患儿治疗失败。其中白血病干细胞(leukemia stem cell, LSC)的残留被认为是白血病耐药和复发的根源。单克隆抗体(单抗)导向的免疫治疗因其对靶细胞具有高度特异性和有效杀伤性而成为目前研究的热点。如果能找到靶向LSC的新单抗,则白血病的治疗和预后将会有新的突破。CD45RA在髓系和B系恶性血液病细胞及LSC上高表达,而在中性粒细胞、血小板、红细胞及记忆T细胞上不表达,故CD45RA可作为杀伤LSC的一个良好靶点。本实验室前期已成功研制抗人CD45RA的鼠单抗3A4及人鼠嵌合抗体scFv3A4-Fc,然而鼠及人鼠嵌合抗体作为异种抗原易引发人抗鼠抗体或人抗嵌合抗体反应。为了进一步降低鼠源抗体的免疫原性,需要对其Fab段也进行人源化改造。由于用传统方法筛选人源化抗体费时费力,故本研究的目的包括获取高亲和力人源化抗体Hu3A4,同时积极探索出一种简便快捷地进行人源化抗体筛选的新方法。另外,探索构建新的免疫毒素以增强抗体的靶向杀伤特性也是本研究的目的之一本研究包括三个部分：1.抗人CD45RA scFv-EGFP融合蛋白(scFv3A4-EGFP)在CHO细胞中的表达及功能研究；2.高亲和力人源化抗体的筛选及功能研究；3.人鼠嵌合抗体免疫毒素(scFv3A4-FcRap)的制备及活性研究。方法1.抗人CD45RA scFv-EGFP融合蛋白(scFv3A4-EGFP)在CHO细胞中的表达及功能研究1.1scFv3A4-EGFP融合蛋白真核表达载体的构建设计包含酶切位点的引物,扩增EGFP基因,将该基因插入pcDNA3.1(+)真核表达载体中构建pcDNA3.1/EGFP质粒,然后酶切替换pHMCH3/scFv3A4-Fc中Fc段从而构建出pHMCH3/scFv3A4-EGFP真核表达载体。1.2scFv3A4-EGFP融合蛋白的表达和活性检测1)通过脂质体转染的方法,以pHMCH3/scFv3A4-EGFP转染CHO细胞,转染后24小时G418加压筛选。2)加压筛选14天左右,RT-PCR,细胞免疫荧光,流式细胞仪分析法检测阳性克隆。3)对阳性克隆进行单克隆化,荧光显微镜观察法筛选出稳定表达细胞株,命名为CHO/scFv3A4-EGFP,同时用RT-PCR方法探索亚克隆出现假阴性原因。4)收集上清,Ni-IDA亲和层析法纯化scFv3A4-EGFP融合蛋白,BCA法测定融合蛋白浓度。5) SDS-PAGE和Western-Blot检测细胞培养上清中scFv3A4-EGFP融合蛋白的表达,并确定分子量大小。6)滴定实验初步了解scFv3A4-EGFP融合蛋白的亲和力。7)抗体阻滞实验和细胞表达谱研究确定scFv3A4-EGFP融合蛋白抗原识别特异性。8)细胞免疫荧光法和BFA阻滞法确定scFv3A4-EGFP融合蛋白在CHO细胞中的分泌途径。9)荧光淬灭法以了解scFv3A4-EGFP融合蛋白的光稳定性。2.高亲和力人源化抗体的筛选及功能研究2.1人源化抗体的理论设计及其真核表达载体的构建1)人源化抗体的设计。首先将3A4的VH及VL基因与人抗体库基因序列进行比对以确定人源化FR模板,将3A4的CDR植入该模板中构建人源化3A4VHa及3A4VLa基因。用Discovery Studio2.5软件模拟3A4的三维结构并确定关键氨基酸残基位置,构建回复突变的人源化3A4VHb及3A4VLb基因。2)人源化抗体真核表达载体的构建。为利于scFv-Fc形式蛋白的纯化,通过PCR方法扩增pHMCH3/scFv3A4-Fc质粒中Fc段,从而将6xH is标签引入,构建新的scFv3A4-FcHis真核表达载体。全基因合成3A4VHa、3A4VLa、3A4VHb及3A4VLb基因。通过重叠延伸PCR (SOE-PCR)方法构建pGEM-T/scFv3A4a及pGEM-T/scFv3A4b质粒,然后通过双酶切构建scFv3A4a-FcHis及scFv3A4b-FcHis真核表达载体。为验证scFv-EGFP融合蛋白可用于人源化抗体筛选,通过酶切方法构建scFv3A4a-EGFP及scFv3A4b-EGFP真核表达载体。2.2高亲和力人源化抗体的表达与筛选1)通过脂质体转染的方法,以pHMCH3/scFv3A4-FcHis、pHMCH3/scFv3A4a-FcHis、pHMCH3/scFv3A4b-FcHis、pHMCH3/scFv3A4a-EGFP及pHMCH3/scFv3A4b-EGFP转染CHO细胞,转染后18小时荧光显微镜观察融合蛋白的表达情况,24小时后G418加压筛选。2)收集转染后24h,48h及72h细胞培养上清,流式细胞仪分析法检测融合蛋白瞬时表达情况。加压筛选14天左右,RT-PCR检测pHMCH3/scFv3A4a-FcHis及pHMCH3/scFv3A4a-EGFP转染细胞株目的基因表达情况。3)通过抗体阻滞实验和竞争性结合实验了解scFv3A4b-FcHis与scFv3A4b-EGFP的抗原识别情况和亲和力。2.3完整IgG形式高亲和力人源化抗体Hu3A4真核表达载体的构建1)构建人重链恒定区(CH)及轻链恒定区(CL)TA克隆载体。提取外周血单个核细胞(PBMC)总RNA, PCR法扩增人CH及CL片段,构建CH及CL TA克隆载体。2)构建人源化重链Hu3A4VH-CH真核表达载体双酶切pGEM-T/CH及pHMCH3/scFv3A4b-FcHis,将目的片段与载体片段连接后构建Hu3A4VH-CH真核表达载体。3)构建人源化轻链Hu3A4VL-CL真核表达载体通过PCR和双酶切首先构建pHMCH3/3A4VLb-FcHis质粒,然后双酶切CLPCR产物及pHMCH3/3A4VLb-FcHis,连接后获得Hu3A4VL-CL真核表达载体。2.4完整IgG形式高亲和力人源化抗体Hu3A4的表达和功能研究1)通过脂质体转染的方法,将pHMCH3/Hu3A4VH-C H及pHMCH3/Hu3A4VL-CL共同转染CHO细胞,转染后24小时G418加压筛选。2)加压筛选14天左右,RT-PCR,细胞免疫荧光,流式细胞仪分析法检测阳性克隆。3)对阳性克隆进行单克隆化,荧光显微镜观察法筛选出稳定表达细胞株,命名为CHO/Hu3A4。4)收集上清,SPA亲和层析法纯化Hu3A4,BCA法测定抗体浓度。5) SDS-PAGE和Western-Blot检测细胞培养上清中Hu3A4的表达,并确定分子量大小。6)滴定实验和竞争性结合实验了解并比较Hu3A4与scFv3A4b-FcHis的亲和力。7)CDC和ADCC实验了解并比较Hu3A4与scFv3A4b-FcHis对靶细胞的杀伤特性。8)观察并比较Hu3A4与scFv3A4b-FcHis对白血病小鼠的治疗情况。3.人鼠嵌合抗体免疫毒素(scFv3A4-FcRap)的制备及活性研究3.1scFv3A4-FcRap免疫毒素真核表达载体的构建全基因合成Rap基因,通过PCR和双酶切构建scFv3A4-FcRap免疫毒素真核表达载体的构建。3.2scFv3A4-FcRap免疫毒素的表达和功能研究1)通过脂质体转染的方法,将pHMCH3/scFv3A4-FcRap转染CHO细胞,转染后24小时G418加压筛选。2)加压筛选14天左右,RT-PCR,细胞免疫荧光,流式细胞仪分析法检测阳性克隆。3)对阳性克隆进行单克隆化,荧光显微镜观察法筛选出稳定表达细胞株,命名为CHO/scFv3A4-FcRap.4)收集上清,Ni-IDA亲和层析法纯化scFv3A4-FcRap,BCA法测定抗体浓度。5) SDS-PAGE和Western-Blot检测细胞培养上清中scFv3A4-FcRap的表达,并确定分子量大小。6)滴定实验和竞争性结合实验了解scFv3A4b-FcHis的亲和力。7)流式细胞仪检测scFv3A4-FcRap对靶细胞的直接杀伤作用。8)流式细胞仪检测scFv3A4-FcRap的内化作用。9)CDC和ADCC实验了解并比较scFv3A4-FcRap与scFv3A4-FcHis对靶细胞的杀伤特性。10)观察并比较scFv3A4-FcRap与scFv3A4-FcHis对白血病小鼠的治疗情况。结果1.抗人CD45RA scFv-EGFP融合蛋白(scFv3A4-EGFP)在CHO细胞中的表达及功能研究：成功构建pcDNA3.1/EGFP和pHMCH3/scFv3A4-EGFP质粒。转染CHO细胞,加压筛选14天左右,RT-PCR检测转染的CHO细胞Cdna可扩增出目的条带,细胞免疫荧光法检查可见转染的CHO细胞内含有目的蛋白。流式细胞仪分析法在转染CHO细胞培养上清中检测到有活性的scFv3A4-EGFP融合蛋白,阳性细胞率为85.82%,经亚克隆后筛选到稳定表达株CHO/scFv3A4-EGFP.对假阴性细胞株进行RT-PCR法证实质粒转染成功。扩大培养CHO/scFv3A4-EGFP后取上清检测阳性细胞率可达97%以上。Ni-IDA亲和层析法纯化scFv3A4-EGFP融合蛋白,BCA法测浓缩纯化蛋白为0.135mg/ml, CHO/scFv3A4-EGFP细胞培养上清浓度约为1350μg/L。SDS-PAGE和Western-Blot鉴定scFv3A4-EGFP分子量约57KDa。滴定实验显示约01μgscFv3A4-EGFP即可饱和1×106KG1a细胞。抗体阻滞实验和细胞表达谱研究证实scFv3A4-EGFP融合蛋白与亲本3A4抗体识别相同的抗原表位。细胞免疫荧光法和BFA阻滞法证实scFv3A4-EGFP融合蛋白在CHO细胞中通过高尔基复合体-内质网途径进行分泌。荧光淬灭法证实scFv3A4-EGFP融合蛋白有良好的光稳定性。2.高亲和力人源化抗体的筛选：根据人源化比对结果选择同源性最高的序列X62106及X86355作为3A4VH人源化模板序列；选择M23090及AF103571作为3A4VL人源化模板序列。用软件确定3A4中14个关键氨基酸位点(注：由于相关位点正准备申请专利故不详述,请各位专家谅解)。成功构建pHMCH3/scFv3A4-FcHis、pHMCH3/scFv3A4a-FcHis、pHMCH3/scFv3A4b-FcHis、 pHMCH3/scFv3A4a-EGFP及pHMCH3/scFv3A4b-EGFP质粒。转染CHO细胞18小时后即可用荧光显微镜观察到含EGFP片段的质粒转染的细胞可发出绿色荧光。流式细胞仪可检测到转染后24h,48h及72h细胞培养上清中scFv3A4-FcHis、 scFv3A4b-FcHis、scFv3A4-EGFP及scFv3A4b-EGFP融合蛋白的表达,且蛋白分泌量随着时间的增加而增多。加压筛选14天左右,RT-PCR检测pHMCH3/scFv3A4a-FcHis及pHMCH3/scFv3A4a-EGFP转染的CHO细胞cDNA可扩增出目的条带。抗体阻滞实验证实scFv3A4b-FcHis与scFv3A4b-EGFP识别相同的抗原表位,而竞争性结合实验表明scFv3A4b-FcHis与scFv3A4b-EGFP有相近的亲和力。3.完整IgG形式高亲和力人源化抗体Hu3A4的制备及功能研究：成功构建pHMCH3/Hu3A4VH-CH和pHMCH3/Hu3A4VL-CL质粒。转染CHO细胞,加压筛选14天左右,RT-PCR检测转染的CHO细胞cDNA可扩增出目的条带,细胞免疫荧光法检查可见转染的CHO细胞内含有目的蛋白。经亚克隆后筛选到稳定表达株CHO/Hu3A4,取上清检测阳性细胞率可达98%以上。SPA亲和层析法纯化Hu3A4抗体,BCA法测浓缩纯化蛋白为0.25mg/ml,推测CHO/Hu3A4田胞培养上清浓度约为2.50μg/ml。SDS-PAGE和Western-Blot鉴定Hu3A4分子量约160kDa。滴定实验显示约0.5μg Hu3A4或1.0μg的scFv3A4b-FcHis抗体即可饱和1×106KGla细胞。Hu3A4的相对亲和力为3.7×1010M-1,而scFv3A4b-FcHis为4.7×109M-1。Hu3A4及scFv3A4b-FcHis的CDC作用均不明显,而ADCC作用随效靶比的增高而增强,并且Hu3A4的ADCC作用强于scFv3A4b-FcHiS。动物实验显示Hu3A4及scFv3A4b-FcHis均可有效治疗白血病小鼠。4. scFv3A4-FcRap免疫毒素的制备和功能研究：成功构建pHMCH3/scFv3A4-FcRap质粒。转染CHO细胞,加压筛选14天左右RT-PCR检测转染的CHO细胞cDNA可扩增出目的条带,细胞免疫荧光法检查可见转染的CHO细胞内含有目的蛋白。经亚克隆后筛选到稳定表达株CHO/Hu3A4取上清检测阳性细胞率可达98%以上.Ni-IDA亲和层析法纯化scFv3A4-FcRap免疫毒素,BCA法测浓缩纯化蛋白为1.5mg/ml,推测CHO/scFv3A4-FcRap细胞培养上清浓度约为4-5μg/ml. SDS-PAGE和Western-Blot鉴定scFv3A4-FcRap分子量约135kDa。滴定实验显示约025μg scFv3A4-FcRap即可饱和1xl06KGla细胞。ScFv3A4-FcRap的相对亲和力为50×1010-1.ScFv3A4-FcRap在体外对KG1a细胞有一定的直接杀伤作用。ScFv3A4-FcRap及scFv3A4-FcHis的CDC作用均不明显,而ADCC作用随效靶比的增高而增强,并且scFv3A4-FcRap的ADCC作用与scFv3A4-FcHis抗体相当。动物实验显示scFv3A4-FcRap及scFv3A4-FcHis均可有效治疗白血病小结论1证实CHO细胞可稳定地表达和分泌抗CD45RA的scFv3A4-EGFP融合蛋白,该表达系统应该也可以用于其他的scFv-EGFP融合蛋白的表达。2开发了一种新的方法(构建人源化scFv-EGFP融合蛋白)以加快抗体的人源化筛选过程。该方法结合计算机分子模拟技术可显著缩短治疗性抗体的开发时间。3成功构建并获得3A4的两种形式人源化抗体scFv3A4b-FcHis及Hu3A4,这些抗体具有良好的ADCC作用,可进一步用于白血病的临床研究。4成功构建并获得scFv3A4-FcRap免疫毒素,该研究成果可用于开发新的人源化免疫毒素。