论文部分内容阅读
背景和目的:EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)可通过干扰宿主基因的表达参与肿瘤的发生发展。窖蛋白-1(Caveolin-1,CAV-1)是多种信号通路的枢纽中心,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用。CAV-1在肿瘤发生发展中具有抑癌和促癌的双面作用,在胃癌中的作用尚存在争议。CAV-1在肿瘤组织中的表达及发挥何种作用与肿瘤组织和细胞类型有关,而EBV相关胃癌(EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC)是胃癌中的一种独特亚群,对以往高通量表达谱数据分析及我们前期实验结果提示在胃癌细胞中EBV可能抑制CAV-1的表达,但EBV对CAV-1的调控作用和机制尚不明确。本研究旨在通过组织和细胞学实验明确胃癌中EBV对CAV-1的调控作用,探讨EBV调控CAV-1表达的机制及CAV-1基因在胃癌发生发展中的作用,为揭示EBV致癌机制提供依据。方法:采用real-time PCR以及Western blotting检测EBV阳性和阴性细胞系中CAV-1表达水平;免疫组化检测EBVaGCC、EBV阴性胃癌(EBV-negative gastric carcinoma,EBVnGC)组织以及癌旁组织中CAV-1表达;通过miRNA mimics、inhibitor转染,检测EBV-miR-BART1-3p对CAV-1的靶向抑制作用;采用亚硫酸氢盐基因组测序法(BGS)检测EBV阳性和阴性胃癌细胞中CAV-1基因启动子及第一外显子甲基化状态,采用甲基化特异性PCR(MSP)检测胃癌组织中CAV-1启动子基因甲基化状态;采用real-time PCR检测EBV阳性和阴性胃癌细胞系DNA甲基化转移酶(DNMTs,包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b)的表达及DNMTs抑制剂5-Aza-dC作用EBV阳性细胞系中CAV-1的表达;采用CCK-8、平板克隆形成试验、凋亡诱导试验以及迁移侵袭试验检测CAV-1 siRNA慢病毒稳定转染的胃癌细胞生物学行为的改变。结果:(1)EBV阳性胃癌和鼻咽癌细胞系中CAV-1的转录水平以及蛋白水平均低于EBV阴性胃癌和鼻咽癌细胞系(P<0.05);EBVaGC组织中CAV-1阳性表达率(2.5%,1/40)低于各项临床指标匹配的EBVnGC组织(22.6%,12/53),差异有统计学意义(P<0.05)。(2)软件预测3种EBV编码miRNAs可与CAV-1基因3’UTR结合(P<0.05),其中EBV-miR-BART1-3p在EBV阳性细胞中呈高表达,但EBV-miR-BART1-3p inhibitor和mimics对EBV阳性细胞系和阴性细胞系中CAV-1的表达无明显影响。(3)EBV阳性胃癌细胞系中CAV-1启动子和第一外显子区37个甲基化位点呈高甲基化,而EBV阴性胃癌细胞系呈低甲基化(P<0.05);MSP结果显示15例EBVaGC组织标本,13例(86.7%,13/15)出现甲基化条带;20例EBVnGC中,12例(60.0%,12/20)出现甲基化条带。(4)EBV阳性胃癌细胞系中DNMT3a表达水平明显高于EBV阴性细胞系,5-Aza-dC作用EBV阳性细胞系中CAV-1表达水平升高。(5)CAV-1 siRNA转染EBV阴性BGC823细胞后有效抑制CAV-1表达,细胞增殖率以及平板克隆形成率增高、抗顺铂诱导凋亡能力提高及细胞迁移和侵袭能力提高(P<0.05);胃癌组织中的CAV-1的阳性表达率(26.5%,13/49)低于配对癌旁组织(83.7%,41/49),差异有统计学意义(P<0.05);91例EBVnGC组织中CAV-1的表达率为28.8%(25/91),CAV-1在分化型胃癌中的表达率高于未分化型(P<0.05),在无淋巴结转移病例中的表达率高于有淋巴结转移的病例组(P<0.05)。结论:(1)EBV对胃癌中CAV-1的表达具有负调控作用,EBV可能通过诱导CAV-1基因启动子高甲基化而非EBV-miRNAs抑制CAV-1表达。(2)与癌旁组织比较,CAV-1在胃癌组织中表达下调,CAV-1表达与胃癌分化程度和淋巴结转移呈负相关,胃癌细胞中CAV-1表达下调可促进细胞增殖、迁移、侵袭以及增强其抗凋亡能力,提示CAV-1在胃癌发生发展中以抑癌基因参与肿瘤。