研究背景子宫内膜异位症(Endometriosis,EM,简称内异症)是以子宫内膜细胞在子宫外异位生长为特征的疾病,好发于育龄期妇女,发病率高达10%～15%,是妇科常见疾病,近年来其发病呈上升趋势。尽管内异症为良性病变,但其某些生物学行为却类似恶性肿瘤,具有组织侵袭、远处生长的能力,可引起盆腔包块、盆腔疼痛、月经失调及不孕等,严重影响着患者的生活质量。目前内异症的治疗方法有期待疗法、药物治疗、手术治疗、手术和药物联合治疗等。除根治性手术外,其他疗法均面临复发可能。但是根治性手术会导致女性过早进入绝经期,出现一系列围绝经期症状,严重影响患者身心健康。内异症成为妇科的难治之症,其原因在于内异症的发病机制不清,缺乏以病因为靶点的治疗方法。因此有待于进一步探求内异症的发病机制,以期针对其发病机制寻找新的治疗方法。目前关于内异症的发病机制存在多种学说,如子宫内膜种植学说、体腔上皮化生学说、诱导学说、免疫学说、遗传因素等,仅用一种或几种学说解释所有内异症的发生机制都有一定的局限性。随着干细胞相关研究的不断深入,越来越多的研究证明子宫内膜存在干细胞,可能来源于胚胎残留干细胞和骨髓来源干细胞,参与子宫内膜的周期性再生。因此,有学者提出了内异症的干细胞学说,认为异位病灶中的终末细胞不能维持病灶的长期发展,干细胞的异位分化增殖可能导致内异症的发生发展。干细胞学说可以归纳为“种子”与“土壤”学说:逆流经血和雌激素及局部微环境是“土壤”,而种植内膜碎片中的干细胞、胚胎残留干细胞、骨髓来源干细胞,甚至种植部位组织中的干细胞是“种子”,只要局部组织中同时存在“种子”和“土壤”,内异症就会发生。干细胞学说为内异症的发病机制研究及临床诊疗提供了新的研究方向。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是定居于骨髓微环境中的一种成体干细胞,具有自我增殖、多向分化的潜能,已经成为本世纪生物医学研究的热点。近年在小鼠和人体实验研究发现骨髓来源干细胞可以迁移至子宫内膜组织,向腺上皮细胞分化,参与子宫内膜的形成,可能是子宫内膜干细胞的来源。徐丛剑等报道BMSCs在体外诱导培养可以向子宫内膜腺上皮细胞分化。Du等报道子宫切除的转基因雌鼠的腹腔内移植野生型小鼠的子宫内膜碎片,在异位内膜间质和腺上皮中可以找到转基因鼠细胞,研究表明子宫外来源的干细胞可以迁移至异位病灶,参与内异症的形成。因此,BMSCs是否可以迁移至异位内膜病灶,向异位内膜腺上皮细胞方向分化,参与内异症的形成有待于进一步研究证实,为内异症干细胞学说提供实验依据。研究表明内异症病灶存在凋亡相关因子的改变,使细胞凋亡易感性下降;内异症病灶高表达血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial cell growth factor,VEGF),微血管密度增加,有利于内异症的血管形成,促进异位内膜种植存活。动物实验及临床研究证实BMSCs移植可用于治疗多种损伤性疾病,如脑缺血、脊髓损伤、心肌梗死及肾损伤等。BMSCs修复损伤组织的机制可能为:在受损组织中有少量BMSCs可以分化为受损组织的细胞,部分补偿或替代其功能;调节损伤组织局部微环境,促进血管形成,抑制细胞凋亡来修复受损组织。因此,BMSCs是否还可以通过局部微环境调节来参与内异症的发生发展有待于进一步研究,为BMSCs在内异症发病机制中的作用研究奠定理论基础,为内异症的防治开辟新的视野。本课题采用全骨髓贴壁细胞分离法分离培养BMSCs,荧光染料PKH26对BMSCs进行标记,观察PKH26对BMSCs的生长特性及体外分化潜能的影响;建立大鼠子宫内膜异位症动物模型,观察腹腔种植、皮下移植和皮下注射三种方法对内异症建模的影响;尾静脉注射移植PKH26标记的大鼠BMSCs后,观察BMSCs在内异症中的迁移分化情况,观察内异症的成模情况及病灶体积、检测内异症病灶的VEGF表达及微血管密度、检测内异症病灶的细胞凋亡及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达情况。第一章大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及PKH26标记目的:建立Wistar大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外分离培养的方法,研究荧光染料PKH26对BMSCs的生长特性及体外诱导分化的影响,为后续的BMSCs在体内示踪、转归分化研究作准备。方法:1.采用全骨髓贴壁细胞分离法分离纯化大鼠BMSCs,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养BMSCs。待细胞铺满瓶底80%～90%时,按1:3比例传代。2.选择培养至第2代的BMSCs,采用流式细胞仪检测细胞表面CD29、CD34、CD44、CD45的表达对细胞进行鉴定。3.采用荧光染料PKH26对第2代的BMSCs进行标记,检测即时标记率。4.通过流式细胞仪检测细胞周期、Annexin-V法检测凋亡率、CCK-8法检测增殖能力,台盼蓝染色检测细胞活力,观察PKH26对BMSCs生长特性的影响。5.通过对第2代的BMSCs体外成骨诱导分化和成脂诱导分化,观察PKH26对BMSCs体外分化潜能的影响。统计学分析:采用SPSS13.0统计软件处理,数据以均数±标准差((?)±s)表示,计量资料比较采用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.体外培养的原代BMSCs接种24h后部分细胞贴附于瓶底,折光性较强;72h后绝大部分细胞贴壁,呈集落样生长。培养9～10d后,集落增多融合成片,铺满瓶底的80%,可进行细胞的首次传代。经消化传代培养的细胞生长迅速,约6～7d可进行传代。传2～3代后,细胞形态趋于一致,为长梭形。2.培养至第2代的细胞95%以上表达CD44和CD29,而CD34和CD45呈阴性,证实为间充质干细胞。3. PKH26标记对BMSCs的细胞活力、增殖能力、凋亡率、细胞周期均无影响(P>0.05)。BMSCs即时标记率达100%。4. PKH26标记的BMSCs经体外诱导培养后可以向成骨细胞和脂肪细胞分化。结论:应用全骨髓贴壁细胞分离法可获得较纯的BMSCs。PKH26标记BMSCs,方法简单,不影响BMSCs的生长特性及多向分化潜能,是BMSCs在体内示踪、转归分化研究的有效方法。第二章子宫内膜异位症动物模型的建立目的:采用腹腔种植、皮下移植和皮下注射三种方法,在动情期进行子宫内膜自体移植,建立大鼠内异症模型,探索一种简便有效的内异症造模方法,为后续的内异症动物模型研究作准备。方法:取性成熟雌性大鼠15只,在动情期采用腹腔种植、皮下移植和皮下注射三种方法将自体子宫内膜组织异位移植,术后4周取出异位内膜组织,观察造模成功率及异位病灶体积大小,HE染色光镜观察异位内膜病灶的形成情况。统计学分析:采用SPSS13.0统计软件分析。计数资料用χ2检验,计量资料以均数±标准差表示((?)±s),采用单向方差分析(One-way ANOVA),组间比较采用多重比较LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.三种造模方法成功率无统计学差异(χ2=2.143, P=0.343),异位病灶体积无统计学差异(F=2.553,P=0.091)。2.三种造模方法异位病灶显微镜下形态相似。异位病灶生长成一个或数个腔样结构,囊壁由内向外分别为上皮细胞层、间质细胞层及少量纤维结缔组织,囊内为粘液和少量炎性细胞。间质层薄,血供丰富,少数可见腺体分布,腺体结构与在位子宫内膜腺体结构相似。囊内壁所衬的腺上皮细胞层以柱状或立方状细胞形成环形生长,部分上皮细胞可见核下空泡。结论:腹腔种植、皮下移植和皮下注射三种内异症造模方法的成功率无明显差异。皮下移植法相对于其它两种方法操作简单,观察直观。第三章大鼠骨髄间充质干细胞在子宫内膜异位症中的迁移分化研究目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)尾静脉移植后在内异症中的迁移及分化情况,探讨BMSCs在内异症发病机制中的作用。方法:1. 12只性成熟雌性大鼠在动情期采用自体右侧宫角子宫内膜组织皮下移植法进行手术造模。造模术后6h,12只大鼠均存活。2.取第2代雄性大鼠BMSCs胰酶消化制成单细胞悬液,进行荧光染料PKH26标记。标记后的BMSCs立即用于模型大鼠的尾静脉移植。造模术后6h将12只模型大鼠随机分成2组。(1)实验组:6只雌性大鼠经尾静脉注射1X107雄性大鼠BMSCs,用lml DMEM-F12培养基悬浮成单细胞悬液。(2)对照组:6只雌性大鼠经尾静脉注射lmlDMEM-F12培养基。3.移植后6周处死大鼠。留取子宫内膜异位病灶和子宫组织。组织冰冻切片厚度为5μm,连续切片2张,1张切片行荧光显微镜检查,另1张切片备行免疫荧光检查。间隔50lμm的厚度重复切片10次。取10张切片直接荧光显微镜检查,观察PKH26标记的BMSCs在内异症中的迁移情况。观察到PKH26标记的细胞,则取其余10张切片行子宫内膜腺上皮细胞特异性标记角蛋白(Cytokeratin,CK)的免疫荧光染色及4,6二脒基-2-苯吲哚二盐酸盐(4,6-diaino-2-phenylindole, dihydrochloride,DAPI)染核。PKH26 阳性为红色荧光,CK阳性为绿色荧光,DAPI阳性为蓝色荧光。每只大鼠共检测10张切片,每张切片荧光显微镜400倍下计数6个非重叠视野的移植细胞数(PKH26阳性、DAPI阳性)及分化为腺上皮细胞的移植细胞数(PKH26阳性、CK阳性、DAPI阳性),计算移植细胞分化率(移植细胞分化率=分化为腺上皮细胞的移植细胞数/移植细胞数×l00%),观察移植的BMSCs在内异症病灶及在位子宫内膜组织的迁移分化情况。4.留取心、肺、肝、肾、卵巢及脑组织标本,冰冻切片厚度为5μm,间隔50μm的厚度重复切片10次。切片直接滴加DAPI染核。每只大鼠每个脏器共检测10张切片,每张切片400倍下计数6个非重叠视野的移植细胞数(PKH26阳性、DAPI阳性),观察移植的BMSCs在大鼠心、肺、肝、肾、卵巢及脑组织的迁移情况。5.留取子宫、内异症病灶、心、肺、肝、肾、卵巢及脑组织标本,采用PCR方法检测雄性大鼠Y染色体特有的Y染色体性别决定区基因(Sex-determining region of the Y chromosome, SRY) 在各组织中 的表达,观察雄性大鼠来源的BMSCs在内异症大鼠体内的分布情况。统计学分析:采用SPSS13.0统计软件处理,数据以均数±标准差(x±s)表示。计量资料的比较采用独立样本t检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1. 12只大鼠均造模成功。移植后6周,实验组6只大鼠均可见红色荧光散在分布于内异症病灶中,移植的细胞数为(241.7±36.4)个,可见少量红色荧光标记细胞同时能被激发绿色荧光,分化为腺上皮细胞的移植细胞数为(13.7±4.3)个,移植细胞分化率(6.6±2.2) %,对照组6只大鼠内异症病灶均未见红色荧光。2.移植后6周,实验组6只大鼠在位子宫组织冰冻切片,荧光显微镜观察均可见红色荧光散在分布于子宫内膜组织中,移植细胞数为(420.2±51.3)个,可见少量红色荧光标记细胞同时能被激发绿色荧光,分化为腺上皮细胞的移植细胞数为(17.8±5.3)个,移植细胞分化率(5.7±1.6) %,对照组6只大鼠子宫内膜均未见红色荧光。内异症病灶的移植分化率与在位子宫内膜组织的移植分化率无统计学差异(t=1.632, P=0.134)。3.尾静脉移植BMSCs6周后大鼠心、肺、肝、肾、卵巢组织可见极少量红色荧光散在分布,脑组织均未见红色荧光。对照组大鼠心、肺、肝、肾、卵巢及脑组织均未见红色荧光。4.移植BMSCs的大鼠子宫、内异症病灶、心、肺、肝、肾及卵巢均可见SRY-PCR阳性,脑组织SRY-PCR阴性。结论:1. BMSCs可以通过血液循环向子宫内膜组织迁移,少量细胞向子宫内膜腺上皮细胞分化,参与子宫内膜的形成,可能是子宫内膜干细胞的来源。2. BMSCs可以通过血液循环向内异症病灶迁移,少量细胞向异位内膜腺上皮细胞分化,参与内异症的形成。3.随血液循环有少量BMSCs可以迁移至心、肺、肝、肾和卵巢,可能参与组织稳态平衡,脑组织未见移植的BMSCs,可能与血脑屏障有关。第四章大鼠骨髓间充质干细胞在子宫内膜异位症局部微环境的调节作用研究目的:观察大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)尾静脉移植后对内异症病灶体积、血管形成及细胞凋亡的影响,探讨BMSCs在内异症局部微环境的调节作用。方法:1. 60只性成熟雌性大鼠在动情期采用自体子宫内膜皮下移植法进行手术造模。造模术后6h,60只大鼠均存活。2.随机分为3组:(1) A组20只雌性大鼠经尾静脉注射1× 107第2代雄性大鼠BMSCs,用1ml DMEM-F12培养基悬浮成单细胞悬液。(2) B组20只雌性大鼠经尾静脉注射1ml DMEM-F12培养基。(3) C组20只雌性大鼠经尾静脉注射生理盐水1ml。3.移植后第2周和第6周随机选择处死各组大鼠10只,测量异位内膜病灶体积,标本行HE染色观察造模成功率,应用免疫组化法检测内异症病灶微血管密度、VEGF、Bcl-2和Bax的表达,采用TUNEL法检测内异症病灶的细胞凋亡。统计学分析:SPSS13.0统计软件处理,实验数据以均数±标准差表示(x±s)。计数资料用χ2检验。多组间不同时间点的数据采用析因分析进行方差检验,各时间点内多组间的比较采用单向方差分析(One-way ANOVA),采用LSD法分析各组间差异。多组等级/频数表资料采用多个独立样本非参数检验(K Independ Sample Test) Kruskal-Wallis H法检验,P<0.05为差异有统计学意义。结果:1. 60只大鼠尾静脉移植后均存活,造模情况:2周和6周时A组分别10只和10只大鼠造模成功、B组分别为10只和9只大鼠造模成功、C组分别为10只和9只大鼠造模成功,A、B、C三组的造模成功率无统计学差异(χ2=1.034,P=0.596)。2.移植后2周和6周时,三组间的异位病灶体积有显著性差异(F值分别为6.900和8.736,P值分别为0.040和0.001),进一步采用LSD法两两比较发现A组的异位病灶体积均大于B组和C组,B、C组间无统计学差异。3.移植后2周和6周时,三组间异位病灶微血管密度有显著性差异(F值分别为10.553和7.444,P值分别为0.000和0.003),进一步采用LSD法两两比较发现,A组的异位病灶微血管密度均大于B组和C组,B、C组间无统计学差异。4.移植后2周和6周时,三组间异位病灶细胞凋亡率有显著性差异(F值分别为4.586和6.108,P值分别为0.019和0.007),进一步采用LSD法两两比较发现,A组的异位病灶细胞凋亡率均低于B组及C组,B、C组间无统计学差异。5.移植后2周和6周时,三组间VEGF表达有显著性差异(χ2分别为6.310和7.031,P分别为0.043和0.030), A组异位病灶均高表达VEGF。6.移植后2周和6周时,三组间Bcl-2表达有显著性差异(χ2分别为6.747和6.360,P分别为0.034和0.042),A组异位病灶均高表达Bcl-2。移植后2周和6周时,三组间Bax表达均无统计学差异(χ2分别为0.052和0.077,P分别为0.974和0.962)。结论:BMSCs移植可以使内异症病灶高表达VEGF,促进血管形成;同时也可使内异症病灶高表达Bcl-2,抑制异位内膜细胞凋亡;增大内异症病灶体积,促进内异症的生长。全文小结1. PKH26标记BMSCs,不影响生长特性及多向分化潜能,是BMSCs在体内示踪、转归分化研究的有效方法。2. BMSCs可以通过血液循环向子宫内膜组织迁移,少量细胞向子宫内膜腺上皮细胞分化,参与子宫内膜的形成,可能是子宫内膜干细胞的来源。3. BMSCs可以通过血液循环向内异症病灶迁移,少量细胞向异位内膜腺上皮细胞分化,参与内异症的形成。4. BMSCs移植可以使内异症病灶高表达VEGF和Bcl-2,促进血管形成,抑制异位内膜细胞凋亡,增大内异症病灶体积,促进内异症的生长。以上研究表明:BMSCs参与内异症发病的可能机制是BMSCs迁移至内异症病灶,少量细胞分化为子宫内膜腺上皮细胞;调节内异症局部微环境,促进血管形成,抑制异位内膜细胞凋亡,有利于异位内膜种植生长。