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新疆野苹果(Malus sieversii Roem1)属第三纪孑遗物种,是现代栽培苹果(Malus domestica Borkh1)的祖先种,遗传多样性丰富。新疆红肉苹果(Malus sieversii f.neidzwetzkyana(Dieck)Langenf)是新疆野苹果的变型,其枝、叶、花、果皮及果肉均为红色,富含花青苷,具有较高的观赏价值和丰富的医疗保健价值。近几年,国外对苹果呈色的分子机理研究有了很大突破,但是,国内外未曾见到新疆红肉苹果呈色机理的研究报道。为此,本研究以新疆红肉苹果‘夏红肉’为试材,测定了果皮、果肉的花青苷组分,克隆了与红色发育相关的MYB转录因子;以白肉野苹果为对照,对花青苷合成代谢相关基因的表达模式进行了分析,并且测定了相应时期花青苷的含量;以‘夏红肉’ב红富士’(Spur Fuji)的杂种分离群体及其亲本为试材,筛选了与红色性状紧密连锁的AFLP分子标记,旨在挖掘与新疆红肉苹果红色形成相关的功能基因,为进一步探明苹果红肉形成的分子机制,利用基因工程培育具有观赏、鲜食与保健功能的苹果红肉新品种奠定理论基础。主要结果如下:1.测定了‘夏红肉’果皮、果肉中花青苷的主要组分及含量。利用HPLC法,检测到新疆红肉苹果果皮、果肉中的主要花青苷组分是矢车菊素-3-半乳糖苷(Cy-3-gal)。利用分光光度法,测定了‘夏红肉’果皮和果肉不同发育时期的花青苷含量,发现其果肉和果皮中花青苷含量的变化趋势明显不同,随着果实的发育,果皮中的花青苷含量呈下降趋势,果肉中花青苷含量则呈上升趋势。2.分离得到了调控花青苷合成的转录因子MsMYB10基因的cDNA和gDNA全长。其中,cDNA GenBank登录号为GQ500894, ORF区域为732 bp,编码一条含244个氨基酸的多肽,预测的PI为8.41,分子量为28.56 kDa。MsMYB10具有R2R3MYB结构域,结构域中有保守的色氨酸残基,在C端有一个富含酸性氨基酸的转录激活区。与已知的MdMYB10氨基酸序列同源性高达98%,MsMYB10没有信号肽,具有核定位信号。进化树分析表明,MsMYB10与调控花青苷合成的转录因子MdMYB10亲缘关系最近,处在同一进化枝。MsMYB10 gDNA总长3981bp, cDNA序列的ORF区域含有两个内含子和三个外显子,内含子长度为256 bp,内含子长度为2994 bp。两个内含子将MsMYB10全长cDNA分割成3个外显子,长度分别为122 bp、132 bp和477 bp。3.MsMYB10的表达与苹果花青苷合成密切相关。利用实时荧光定量PCR技术,以新疆野苹果‘夏红肉’和‘白肉’为试材,测定了果实发育期调控苹果花青苷合成的转录因子MsMYB10的表达量。结果显示:MsMYB10在‘夏红肉’果皮与果肉中的表达量非常高,随着果实的成熟,果皮中MsMYB10的表达量均呈递增趋势,果肉中MsMYB10的表达量呈‘高-低-高-低’的变化趋势;而在对照‘白肉’苹果中的表达量却很低,果肉中几乎不表达,果皮中MsMYB10的变化趋势与‘夏红肉’相似,随着果实的成熟, MsMYB10表达量急剧升高。‘夏红肉’与‘白肉’苹果果肉MsMYB10表达量差异导致它们花青苷含量与着色差异。测定了MsMYB10在‘夏红肉’的嫩枝、嫩叶、果皮、果肉中的表达量。结果发现:该基因在果皮中的表达量最高,其次为果肉,在叶中的表达量最低,与上述组织中花青苷含量差异相一致。4.花青苷合成结构基因与苹果呈色差异关系分析。利用实时荧光定量PCR技术,以新疆红肉苹果‘夏红肉’和‘白肉’为试材,测定果实发育期花青苷合成途径中结构基因MsCHS、MsCHI、MsUFGT、MsDFR1、MsDFR2、MsF3H、MsLDOX的表达量。结果显示,结构基因在‘夏红肉’和‘白肉’之间表达存在显著差异。在果实发育前期,‘夏红肉’果皮和果肉中的表达水平明显高于对照‘白肉’,其中,二者果肉中基因的表达量差异较果皮明显。‘夏红肉’果肉中, MsCHS、MsCHI、MsLDOX、MsUFGT的基因表达量存在显著差异。其中MsCHS、MsCHI、MsLDOX在果肉中的表达水平前三个测定时期都高于对照白肉野苹果,三者在‘夏红肉’中的表达量分别约为‘白肉’苹果的3~10倍、3~37倍和2~7倍。MsUFGT在果肉中的表达水平,第一和第三个测定时期的表达量明显高于相应时期的白肉野苹果,第一个测定时期的表达量约为对照的40倍。初步认为MsCHS、MsCHI、MsLDOX、MsUFGT与红肉形成密切相关。‘夏红肉’果皮中MsDFR1、MsDFR2、MsLDOX的表达量在‘夏红肉’和‘白肉’之间差异比较明显。其中红肉苹果果皮中MsDFR1、MsDFR2表达量后三个测定时期都高于对照白肉苹果,二者在‘夏红肉’中的表达量分别约为‘白肉’苹果的2~7倍、4~10倍,‘夏红肉’果皮中MsLDOX的表达量在中间两个测定时期高于对照,约为对照的5-20倍。其它待测基因在第二个测定时期的表达量明显高于对照。‘夏红肉’果皮中,除MsLDOX外,其余六个结构基因的表达量在第二个测定时期都最高,之后表达量呈下降趋势,这与‘夏红肉‘果皮中花青苷的积累趋势一致。初步认为MsDFR1、MsDFR2、MsLDOX与红皮形成密切相关。5.MsMYB10基因在原核中成功表达,获得了28.8kd大小的融合蛋白。将MsMYB10编码区连接到原核表达载体PET-30a(+),构建了MsMYB10基因的原核表达质粒pET30a-MsMYB10,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在IPTG诱导下,获得了预期大小28.8kd的融合表达蛋白。6.筛选到一个与红肉苹果红色性状连锁的AFLP标记,大小300bp左右。采用64对AFLP引物组合对红色/绿色DNA基因池进行红色性状分子标记的筛选,其中引物组合EocRI-ACC / MseI-CAG在两个基因池间产生300 bp左右多态性片断,F1子代进一步验证表明在10个红色DNA池成员和10个绿色DNA池成员间,该片段表现出连续的差异,初步认为该基因与红色性状有关。