重组TORC1慢病毒载体修复大鼠脊髓损伤的实验研究

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第一部分大鼠TORC1基因的扩增及重组慢病毒载体的构建目的:构建携带大鼠TORC1(transducer of regulated CREB activity 1)目的基因的重组慢病毒,并初步检测其体外表达目的基因的能力。方法:PCR法扩增出TORC1编码区片段,定向克隆入pGC-FU载体,Lipofectamine 2000法转染293T细胞包装携带TORC1目的基因的重组慢病毒,测序证实为TORC1重组慢病毒后大量扩增,以实时定量PCR法测定病毒滴度,western blot法检测TORC1在293T细胞中的表达。结果:成功构建了携带大鼠TORC1目的基因的重组慢病毒,并证实其在293T细胞中可高水平表达TORC1。结论:大鼠TORC1重组慢病毒可在体外高表达其所携带目的基因,为研究TORC1在脊髓损伤中的作用打下基础。第二部分TORC1重组慢病毒的体外生物学效应目的研究TORC1重组慢病毒载体对大鼠原代脊髓运动神经元(SMN)的生物学效应。方法取1-3 d新生大鼠进行原代SMN培养,用构建好的TORC1重组慢病毒载体转染SMN,应用RT-PCR、Western Blot及细胞形态学验证其对SMN TORC1mRNA、蛋白表达的影响,以及对SMN生长情况的作用。结果成功培养出大鼠原代SMN,用构建的TORC1重组慢病毒载体转染原代SMN,可以明显提高TORC1mRNA和蛋白的表达水平,并改善了神经元轴突生长情况。以正常组和空白载体组细胞作对照,实验组TORC1 mRNA和蛋白表达量均有明显提高(P<0.05),而且效果持久,同时实验组神经轴突长度明显优于其他2组(P<0.05)。结论TORC1重组慢病毒载体可以有效地提高SMN TORC1基因表达并促进其生长,为后续动物实验奠定了基础。第三部分TORC1重组慢病毒修复大鼠脊髓损伤的研究目的:建立大鼠脊髓损伤模型,研究TORC1重组慢病毒载体在脊髓损伤修复中的作用。方法:取健康成年SD大鼠,切断T10脊髓,建立脊髓损伤动物模型,术中将TORC1重组慢病毒载体和pGC-FU载体注入损伤区,术后2周、4周、6周进行BBB评分,并通过RT-PCR、Western Blot检测TORC1 mRNA及蛋白表达,同时进行免疫组化染色观察神经纤维再生情况。结果:术后第2周,实验组除TORC1蛋白表达水平上调外组(P<0.05),TORC1 mRNA表达、BBB评分以及损伤区神经纤维再生情况与阴性对照组没有差异(P<0.05),但第4周时,实验组这4个指标明显优于阴性对照组(P<0.05),这种优势在第6周也同样存在。结论:TORC1重组慢病毒载体可有效改善大鼠脊髓损伤,而且效果持久,具有很好的应用前景。
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