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硫酸乙酰肝素（HS）是具有抗凝血、抗血栓、抗艾滋病病毒感染和减缓细胞体外凋亡的一种药物，大肠杆菌K5多糖为采用酶法合成的方法合成HS的底物。本论文为提高K5多糖的产量，通过正交试验优化发酵条件，确定了优化培养基组成和优化的培养条件，并进行了发酵过程研究。在发酵过程研究中发现K5裂解酶对K5多糖的降解作用，其降解产物为平均分子量为3852Da的低分子量K5多糖。根据K5裂解酶的这一特性，将其作为生产低分子量K5多糖的工具酶，本论文对K5裂解酶基因elma进行扩增，构建表达载体pET-28a-Elma，在大肠杆菌BL21中进行诱导表达，并通过Ni2+-NTA亲和层析法和G-75分子筛层析纯化目的蛋白，得到纯的目的蛋白，并对克隆表达的酶进行酶学性质研究。同时对产K5多糖的大肠杆菌进行K5裂解酶的敲除，来研究K5裂解酶的缺失对K5多糖生产的影响。分别得到了以下结果：(1)通过正交试验的方法进行发酵条件的优化，得到优化培养基组成为：其优化的培养基组成为ρ（MgSO47H20）2.0g/L，ρ（麦芽糖）20g/L，ρ（蛋白胨）15g/L，MnCl44H2O0.1g/L，KH2PO42g/L， K2HPO49.7g/L，脱水枸橼酸钠0.5g/L。优化装液量为15mL。并对摇瓶及5L发酵罐进行发酵过程研究，绘制发酵过程曲线。K5多糖产量可达1.8g/L。对5L发酵产物进行分子量分析，发现K5多糖的分子量随着发酵时间的延长分子量降低，从而证明发酵液中裂解酶的存在。(2)利用PCR方法扩增elma，构建表达载体pET-28a-Elma，将构建好的质粒转化至大肠杆菌BL21中，以0.2mmol/L的IPTG在16℃诱导5h实现了高效表达，SDS-PAGE分析表明Elma表达量可达菌体总蛋白的30%以上。采用Ni2+-NTA亲和层析法和G-75分子筛层析纯化目的蛋白，其纯度大于95%。通过PAGE多糖电泳发现裂解前后的K5多糖相对分子量有明显的减小。根据Elma裂解产物产生双键从而在232nm处有吸光度的变化来测Elma的酶活。其优化后的反应温度为37℃，反应的优化后的pH值为7.0。底物特异性分析发现Elma除K5多糖外对肝素和透明质酸也有降解作用。(3)利用Red重组系统对大肠杆菌进行基因敲除，通过PCR成功克隆了具有K5-lys片段同源臂的氯霉素抗性片段，用L-阿拉伯糖诱导同源重组，构建了E.coli K5△K5-lys。E.coli K5△K5-lys比出发菌株裂解酶活性降低了50%，但其在高浓度碳氮源发酵培养基中失去了生长能力。