背景:心血管疾病在发达国家,甚至全球范围内已经成为最普遍的致死病因,而动脉粥样硬化是心血管疾病中最重要的病理生理基础。外科手术治疗,包括血管成形术、支架植入、经皮腔内斑块旋切术和心脏搭桥等在内,对于存在严重生命威胁的冠状动脉粥样硬化性心脏病来说,仍然是必不可少的治疗方式。但是,手术过程中机械性损伤导致的血管再狭窄的发生,是阻碍这些患者预后的最显著病理性问题。众所周知,血管再狭窄发生的最显著特征就是动脉新生内膜的形成。在其形成过程中,血管平滑肌细胞在多种病理因素刺激下,会出现向去分化状态的转变并且增殖、迁移能力显著增强,同时分泌更多的细胞外基质。但是,由于缺乏对血管再狭窄发生发展分子机制的清晰认知,让其治疗依然远不如人意。天然免疫信号网络能够通过作用于非免疫细胞,来影响心血管疾病的进程。干扰素调节因子(IRFs)最初是作为I型干扰素的转录调节因子而被认知,目前认为其也是调节天然免疫信号通路的重要调节因子。越来越多的研究证实,IRFs同样在影响胰岛素抵抗、心脏疾病、细胞存活、肿瘤生成以及内膜增生的疾病进程中扮演着重要的角色。作为IRFs家族中的第四个成员,IRF4最开始是表达于B和T淋巴细胞,并且能够调节宿主免疫细胞的分化。与家族其他成员相类似的是,IRF4的N端存在着一个高度保守的DNA结合结构域(DBD)和C端的IRF相关结合结构域(IAD1)。一定的环境刺激下,通过IAD1与其协同因子相互作用后,IRF4可以进一步通过DBD结构域与其靶基因的干扰素刺激反应元件(ISREs)相结合,调节靶基因的转录活性。前期大多数的研究表明,IRF4在调节淋巴细胞、骨髓细胞和树突细胞的分化过程中起着重要的作用,同时IRF4也有一定的肿瘤抑制功能。而且,IRF4也可以通过调节巨噬细胞极化,抑制代谢性疾病,并且通过与过氧化物酶增值激活受体γ(PPARy)的共激活剂1 α(PGC-1 α)直接相互作用,使其作为生热作用基因表达的重要转录调节因子。我们近期的研究工作发现,IRF4过表达能够促进cAMP应答元件结合蛋白(CREB)的转录激活,加重心肌肥厚;IRF4也可以增加血清反应因子(SRF)表达抑制缺血性脑卒中的发生。这些结果表明,在不同病理生理条件下,IRF4可以通过调节不同的下游信号通路,起着完全不同的作用。因此,探究作为天然免疫反应重要调节因子的IRF4是否参与、如何调节新生内膜形成非常重要,这对于深入理解血管再狭窄的潜在机制同样至关重要。目的:阐明IRF4对血管损伤诱导的血管平滑肌细胞表型转化和血管内膜增生的影响,以及其潜在的分子机制。方法:第一部分:在支架术后再狭窄病人和颈动脉导丝损伤模型小鼠的狭窄血管中,检测IRF4基因在血管内膜增生中是否存在作用。我们首先采用qPCR及western blot检测IRF4的表达水平;随后构建IRF4基因全敲大、小鼠,通过EVG染色进行形态学检测,验证IRF4表达水平的改变对血管内膜增生的作用。第二部分:收集支架术后再狭窄病人的狭窄血管,以及导丝损伤模型不同时间点的小鼠血管,采用免疫荧光双染和western blot检测IRF4在平滑肌细胞中的表达情况。第三部分:采用SMC-Cre和SMC-IRF4-KO小鼠,建立颈动脉导丝损伤模型,明确平滑肌细胞特异性IRF4敲除对血管内膜增生发挥的重要作用。通过EVG染色,进行形态学评价;免疫荧光染色和western blot检测平滑肌细胞增殖、迁移标记物蛋白水平的表达;同时,PDGF-BB体外处理分离的原代平滑肌细胞,通过qPCR检测平滑肌细胞增殖、迁移标记物mRNA水平的表达;利用Brdu检测平滑肌细胞的增殖能力以及Transwell检测平滑肌细胞的迁移能力。第四部分:构建平滑肌细胞特异性IRF4转基因小鼠(SMC-IRF4-TG),同时入组WT对照组小鼠建立颈动脉导丝损伤模型,明确IRF4过表达能够逆转血管内膜增生的形成。通过EVG染色,进行形态学评价;免疫荧光染色、qPCR和western blot检测平滑肌细胞增殖、迁移标记物的表达;同时,PDGF-BB处理分离的原代平滑肌细胞,利用Brdu检测平滑肌细胞的增殖能力以及Transwell检测平滑肌细胞的迁移能力。第五部分:采用导丝损伤后14天的WT和IRF4-KO小鼠颈动脉组织,进行全基因组芯片分析和富集通路的检测。通过qPCR、免疫荧光染色和western blot对靶基因KLF4的改变进行验证。利用生物信息学预测KLF4启动子上与IRF4直接结合的ISRE结合区域,通过ChIP和Luciferase技术,明确IRF4对KLF4的转录调控。第六部分:通过IRF4flox/flox/SM22α-Cre小鼠与SMC-KLF4-TG交配得到SMC-IRF4-KO-KLF4-TG 小鼠;通过 SMC-KLF4-KO 小鼠与 SMC-IRF4-TG 交配得到SMC-IRF4-TG-KLF4-KO小鼠,建立小鼠颈动脉导丝损伤模型,明确KLF4对IRF4调控的血管内膜增生的介导作用。通过EVG染色,进行形态学评价;免疫荧光染色检测平滑肌细胞增殖、迁移标记物的表达。第七部分:采用SMC-Cre和SMC-IRF4-KO小鼠、WT和SMC-IRF4-TG小鼠建立颈动脉导丝损伤模型。免疫荧光染色、qPCR和western blot检测平滑肌细胞分化基因的表达;同时,PDGF-BB处理分离的原代平滑肌细胞,通过qPCR检测平滑肌细胞分化基因的表达。结果:第一部分:在狭窄的人体血管中,IRF4的mRNA和蛋白水平表达均明显下调;在左颈动脉导丝损伤模型的小鼠血管组织中,mRNA和蛋白水平的结果均显示,IRF4在损伤后7天和14天的表达明显升高,且在14天达到高峰,但是28天后出现显著的下降并且低于未损伤的本体水平;通过IRF4全敲大、小鼠,建立相应的血管损伤模型,发现IRF4敲除大、小鼠的新生内膜面积,以及内膜/中膜比值在损伤后7,14,28天均有显著的增加。第二部分:使用平滑肌细胞特异性标记物α-SMA(绿色,平滑肌细胞)和IRF4(红色),DAPI(蓝色,细胞核)抗体,通过免疫荧光共染发现IRF4主要定位于人体和小鼠狭窄血管的平滑肌细胞中,且表达水平与mRNA和蛋白水平的检测相一致。分离不同损伤点的颈动脉组织中的平滑肌细胞进行培养,也得到相类似的结果。第三部分:在损伤14天和28天后的小鼠血管中,通过EVG染色,发现SMC-IRF4-KO小鼠促进新生内膜的形成,同时增加内膜/中膜比值。进一步通过免疫荧光和western blot检测,明确SMC-IRF4-KO促内膜增生效应主要依赖于促增殖因子Cyclindl和PCNA,以及促迁移因子MMP2的表达上调,而增殖抑制因子P21的表达则发生下调。PDGF-BB刺激分离的原代平滑肌细胞得到的qPCR结果也显示SMC-IRF4-KO能促进Cyclindl和PCNA的转录,抑制P21的转录。同时通过BrdU和Transwell检测,SMC-IRF4-KO显著促进PDGF-BB诱导的平滑肌细胞的增殖和迁移。第四部分:在损伤14天和28天后的小鼠血管中,通过EVG染色,发现SMC-IRF4-TG小鼠抑制新生内膜的形成,同时降低内膜/中膜比值。进一步通过免疫荧光和western blot检测,明确SMC-IRF4-TG抑制内膜增生效应主要依赖于促增殖因子Cyclindl和PCNA,以及促迁移因子MMP2的表达下调,而增殖抑制因子P21的表达则发生上调。PDGF-BB刺激分离的原代平滑肌细胞,通过BrdU和Transwell检测发现,SMC-IRF4-TG显著抑制PDGF-BB诱导的平滑肌细胞的增殖和迁移。第五部分:通过全基因组芯片分析和富集通路的检测,发现IRF4敲除小鼠中增殖相关性的基因(Cyclindl和PCNA)、迁移基因(MMP2)、平滑肌细胞分化基因(α-SMA、SM22α和Smoothlin)以及炎症发生相关基因(TNF-α、iNOS和IL-6)出现明显的增加,而增殖抑制性基因(P21、KLF4)和抗炎基因(Retnla、Arg-1、PPARy和Chi313)则出现明显的下降趋势。而在这些改变的基因中,KLF4在调节平滑肌表型修饰和内膜增生的形成中起着重要的作用。SMC-IRF4-KO小鼠抑制KLF4的mRNA和蛋白水平的表达,以及平滑肌细胞中KLF4的表达,而SMC-IRF4-TG则逆转这一效应。通过生物信息学分析,我们在KLF4基因启动子上鉴定出6个IRF4的假定ISRE结合区域。ChIP分析显示P3(-1544～-1435)和P4(-1003～-910)是其中结合最强的两个ISRE区域,能够使IRF4结合到KLF4基因启动子上。通过Luciferase分析得知,PDGF-BB刺激能够显著增强KLF4的转录活性,而IRF4敲除则消除这一效应,IRF4过表达则增强KLF4的活性。在平滑肌细胞系(MOVAS)细胞中,腺病毒介导的IRF4过表达,同样能够促进KLF4的转录活性,而突变KLF4启动子中与IRF4相结合的ISREs区域,则能够消除IRF4特异性的效应。第六部分:构建平滑肌细胞特异性IRF4-KO-KLF4-TG小鼠和IRF4-TG-KLF4-KO小鼠,通过EVG染色和免疫荧光染色,证实了 IRF4对血管内膜增生的调节主要依赖于KLF4。第七部分:通过免疫荧光染色和western blot,观察到损伤后14天和28天的血管组织切片中,SMC-IRF4-KO能够促进平滑肌细胞分化型标记物α-SMA、SM22α和Smoothelin的表达,而SMC-IRF4-TG小鼠则抑制其分化。PDGF-BB刺激分离的原代平滑肌细胞的qRCR结果也进一步证实了这一结果。