目的：建立高效稳定的大鼠毛囊干细胞(hair follicle stem cells, FSCs)和毛囊成纤维细胞原代取材、分离、培养方法,并对所得细胞进行鉴定。制备七厘散含药血清,将七厘散含药血清加入FSC培养体系中,明确其对FSC增殖的促进作用。选用皮耐克作为组织工程皮肤支架,将毛囊成纤维细胞与皮耐克支架复合构建人工真皮,再将FSC与人工真皮共培养,构建组织工程皮肤。制作裸鼠全层皮肤缺损模型,将构建的组织工程皮肤移植入皮肤创面,探讨七厘散对FSC组织工程皮肤修复创面的影响。由于七厘散复方药物成分复杂,为了进一步探讨中药有效成分在FSC修复皮肤创面中的作用机理,本研究选用七厘散中君药血竭的主要活性成分——龙血素A单体干预FSC,探讨其对FSC生长及细胞周期的影响,并进一步检测Wnt/β-catenin信号通路中主要蛋白和下游基因表达的变化,初步探讨龙血素A对FSC增殖或定向分化的分子机制。方法：采用“两步酶”消化法获取乳鼠触须部皮肤FSC,毛囊成纤维细胞采用组织块法培养,免疫荧光检测培养的FSC中角蛋白15 (cytokeratin 15, CK15),角蛋白19(cytokeratin 19, CK19)、β1整合素的表达以及毛囊成纤维细胞中纤维连接蛋白(fibronectin, FN)、层粘连蛋白(laminin, LN)、波形蛋白(Vimentin)的表达。严格遵循“通法”制备大鼠七厘散含药血清。 噻唑蓝(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide, MTT)法探究不同时间点、不同体积百分比七厘散含药血清作用于FSC后的细胞活性。将毛囊成纤维细胞接种于皮耐克真皮支架构建真皮,表面种植5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU)标记的FSC, Transwell双层培养板进行气-液界面培养,构建FSC组织工程皮肤。制作裸鼠背部皮肤缺损模型后将动物随机分为A、B组,A组用生理盐水预处理创面,B组用七厘散预处理创面,然后各动物创面均移植构建的FSC组织工程皮肤。移植后再将每组动物随机分为5小组,分别对移植处创面进行生理盐水、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)阳性药物、七厘散内服、七厘散外用、七厘散内服+外用方式处理。每日观察并记录创面大体愈合情况,制订评分标准,统计得分。于移植后3d、5d、7d、14d在原创面处取材,标本作病理学和免疫荧光组织化学检测。MTT法探究不同时间点、不同浓度龙血素A对FSC增殖的影响。流式细胞仪检测龙血素A对FSC细胞周期的影响。Western Blot、实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术对龙血素A干预的FSC胞质内β-catenin、糖原合成激酶(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)蛋白以及核内转录因子3 (transcription factor 3,Tcf3)、淋巴增强因子1 (lymphoid enhancer factor, Lefl)、c-myc、cyclin D1基因的表达进行检测。结果：“两步酶”法分离、培养的细胞为圆形或多角形,典型铺路石状,呈CK15、CK19、β1整合素表达阳性；组织块法获得的细胞为纺锤形,FN、LN、Vimentin表达阳性。连续灌胃3d、体积百分比为2.5%的七厘散含药血清作用于FSC 24h的促增殖效果最佳。毛囊成纤维细胞与皮耐克复合,连续培养5d,构建的真皮无污染,细胞生长良好。将FSC与人工真皮复合后继续培养5d,再进行气-液界面培养5d后,得到的人工皮肤复合物质地柔软,有一定的韧性和弹性。FSC组织工程皮肤移植后,各组动物生存状态良好,创面无感染、出血,移植物无脱落,亦无明显的免疫排斥反应。术后3d创面逐渐缩小,血痂形成。术后5d血痂逐渐变硬,变厚。术后7d痂面面积慢慢变小,痂面周缘可见新生皮肤。术后14d大部分裸鼠血痂脱落,其中A、B两组中七厘散外用组和七厘散内服+外用组血痂脱落较其余组早。术后14d,A、B两组中七厘散外用组和七厘散内服+外用组裸鼠创面已上皮化,移植处新生皮肤较厚,质地柔软,呈白色或粉肤色,可与正常皮肤相区别。通过观察创面愈合情况,制订评分标准,半定量统计结果显示术后3d,A、B两组平均得分差异有统计学意义,表明七厘散预处理创面在愈合早期能抑制创面出血、减轻炎症反应、促进创面结痂,对促进创面修复有积极作用；A、B两组各用药组与生理盐水对照组相比,差异有统计学意义,说明在移植后早期,不同的用药方式对伤口的愈合有影响。术后5d,创面进入修复期,两组修复状况无明显差别。术后7d和14d, A、B两组平均得分差异均有统计学意义,其中B组七厘散外用组、七厘散内服+外用组平均得分最高,显示外用和内服+外用为七厘散最佳用药方式。病理学结果显示,术后3d各组炎性反应明显,创面有血痂覆盖,可见未降解的皮耐克支架与大量淋巴细胞,七厘散外用组创面细胞增多密集。术后5d各组炎症反应减轻,各组表皮细胞开始增生,但未完全覆盖创面,新生上皮与真皮连接不紧密,容易分离,B组肉芽组织增生明显。术后7d各组炎症反应明显减轻,胶原纤维增多,创缘可见较厚新生表皮。术后14d各组未见明显支架材料,A、B两组中生理盐水对照组和七厘散内服组有少量创面未愈合,其余各组创面均愈合,表皮和真皮分层明显,分化良好。免疫荧光检测显示,术后各组中BrdU标记的FSC呈CK15、CK19和β1整合素阳性表达,随着移植时间的延长,各组标本中角蛋白14 (cytokeratin 14, CK14)的表达均逐渐增多增强。MTT结果显示20μg/mL龙血素A作用于FSC 24h的促增殖效果最佳,流式细胞术分析发现,龙血素A作用后,S期和G2期细胞数量增加,龙血素A促进细胞向S期和G2期转变。龙血素A干预FSC后,Wnt经典通路中GSK-3p表达减少,β-catenin表达增多,核内Tcf3、Lefl、c-myc和cyclin D1基因的mRNA表达均上调。结论：七厘散含药血清能促进FSC的增殖。七厘散通过“祛瘀生肌”,改善创面微环境,促进FSC组织工程皮肤修复全层皮肤缺损,植入的FSC参与新生表皮的形成。龙血素A通过激活Wnt/β-catenin信号通路,改变FSC细胞周期,进而促进FSC增殖和分化。