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【研究背景及目的】非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是代谢综合征在肝脏的具体表现。NAFLD病理学变化,主要为肝细胞的脂肪变性。疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝(non-alcoholic simple fatty liver,NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitish,NASH)、肝硬化、肝细胞癌(HCC)。随着肥胖相关的代谢综合征在世界范围的流行,近些年亚洲国家NAFLD增长迅速、低龄化。在中国发达地区,NAFLD患病率约达15%。然而NAFLD的病因和发病机制并不明确。我国仍是病毒性肝炎高发国家,以慢性HBV和HCV感染为主。而随着NAFLD的流行,慢性病毒性肝炎合并NAFLD的发病率逐年上升,有些地区发病率高达27%-51%,这两种疾病的合并引起了我们广泛关注。目前,关于HCV合并NAFLD,已有一些比较明确研究。NAFLD可促进HCV患者进展为肝硬化、肝癌,而HCV又可导致肝细胞脂肪变性,因而形成正反馈进一步加重NAFLD的进展。而HBV合并NAFLD患者中,HBV复制和NAFLD相互关系,尚无定论。目前,该领域的研究主要集中在对一些临床现象的观察,且研究结果尚不一致。NAFLD的研究主要集中在对一些临床现象的观察,且研究结果尚不一致。部分研究认为,NAFLD促进HBV清除;有些研究表示,NAFLD对HBV复制没有影响;还有研究证明,脂肪肝可促进HBV复制,降低CHB的抗病毒疗效,增加CHB进展为肝硬化、HCC的风险。关于HBV是否也如HCV一样,可以诱导肝细胞脂肪变?是否会引起脂质代谢紊乱?目前这方面的研究主要利用通过转染HBV相关质粒入肝癌等细胞模型以及临床病人标本,临床病人主要通过超声诊断脂肪肝,病人肝穿样本为诊断脂肪肝的金标准,但存在样本数量有限以及病人的依从性等不足。动物模型能避免以上两种模型的缺陷,但目前乙型病毒性肝炎合并NAFLD的动物模型主要是转基因小鼠,缺乏免疫完全的乙型肝炎病毒持续复制的小鼠模型,而本研究提供的动物模型可以弥补以上的不足。本研究的具体目标如下:1建立HBV持续复制合并NAFLD的动物模型;2.观察NAFLD对HBV复制的影响以及动态观察HBV对脂质代谢的影响,主要是对胆固醇的合成和代谢的影响,并探讨相关代谢分子机制。【研究方法】1.通过尾静脉高压注射基因B型的HBV复制DNA质粒(p GEM4Z/HBV1.3)到FVB/N雄性小鼠肝细胞内,隔日眼内眦静脉采血检测血清HBe Ag的滴度,HBe Ag阳性小鼠开始采用60%高脂饲料喂养14周,观察小鼠的状态、体重以及习性的改变,检测血清生化指标(ALT、AST、Glucose、HDL、LDL、TG、TC、胰岛素)和动态观察肝组织切片的变化(HE、油红染色)。2采用.免疫组化测肝组织HBc Ag表达,免疫化学发光方法测血清HBe Ag和肝组织HBs Ag。定量PCR以及Southernblot测肝组织HBV DNA,观察HBV复制的变化。肝组织匀浆酶法定量检测TG和TC,RT-PCR测肝组织TC合成和代谢相关基因的表达来观察HBV持续复制对TC代谢的影响。3.采用MDA-TBA法,检测肝组织脂质氧化产物MDA。【实验结果】1.成功建立HBV持续复制合并NAFLD的动物模型。隔日采血,小鼠血清HBe Ag带原率85%左右。高脂饮食喂养14周,FVB/N小鼠不喜活动,体型肥胖,毛发油腻,体重明显增加;小鼠血清HBe Ag带原率下降为70%左右;外周血生化指标(ALT、AST、Glucose、HDL、LDL、TG、TC、胰岛素)及HOMA-IR明显升高且有统计学差异(P<0.05),小鼠肝重较对照组(ND)增加,肝组织色泽偏黄,边缘圆钝,表面有油腻感,触之易碎;肝组织HE和油红切片染色,可见肝细胞有大量脂肪滴存在。2.免疫组化表明HBc Ag在HBV、HBV合并NAFLD组的肝细胞内均有表达,高倍视野下,阳性细胞数(400倍),在HBV合并NAFLD组降低,有统计学差异(P<0.05);免疫化学发光法检测血清HBe Ag和肝组织HBs Ag发现在合并组较HBV组均明显下降且有统计学差异(P<0.05);定量PCR检测肝组织HBV DNA显示在合并组较HBV组明显下降,并有统计学差异(P<0.05)以及Southernblot也证明HBV在合并组复制减少,同时HBV DNA与HBe Ag、HBs Ag及HBc Ag有较强的正相关。3.酶法检测肝组织TG,HFD组较ND组明显增加且有统计学差异(P<0.05);酶法检测肝组织TC及RT-PCR检测TC合成和代谢的基因(SREBP2、HMGCR、LDLR、CYP7a)显示,造模第4W四个实验组没有统计学差异,6W HBV组肝组织TC和TC合成基因较HBV合并NAFLD组、NAFLD组、Control组增加,有统计学差异(P<0.05),持续到10W、12W,然而,在14W四组肝组织TC无统计学差异,相关基因明显下调,且有统计学差异(P<0.05)。4.MDA-TBA法检测肝组织脂质氧化产物MDA,HBV组较HBV合并NAFLD组、NAFLD组、Control组明显增加,且有统计学差异(P<0.05)。【实验结论】1.本研究成功建立HBV持续复制合并NAFLD小鼠模型,为研究二者之间的相互关系奠定了基础。2.在该模型中,NAFLD可以抑制HBV的复制,降低外周血HBe Ag、肝组织HBs Ag和HBc Ag。3.在该模型中,HBV持续复制,可影响TC代谢相关基因的表达。4.在该模型中,HBV持续复制,促进脂质氧化,增强肝组织的氧化应激。