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共轭亚油酸(Conjiugated linoleic acid,CLA)是亚油酸(Linoleic acid,LA)的一组位置和构象异构体的总称,近年来,大量研究报道CLA具有抗癌、抗动脉硬化症、减肥、提高机体免疫等功效,引起了人们对CLA研究的极大关注。本文从菌株分离筛选出发,对分离所得菌株合成CLA的能力进行检测:对高产CLA菌株进行鉴定以及诱变选育,并对筛选得到的诱变高产菌株进行LA耐性以及产物CLA异构体的分析和检测;随后通过对CLA合成过程中的关键酶——亚油酸异构酶(Linoleic acid isomerase,LAI)基因的扩增和分析以及在酵母表面展示表达来探讨CLA合成的机理;通过将LAI在植物乳杆菌表面展示表达来构建基因工程菌株,以期增加CLA产量。论文的主要研究结果如下:
采用梯度稀释法从三种不同的泡菜中筛选得到乳酸菌78株以及实验室保存菌株8株,共有出发菌株86株菌。通过紫外分光光度法,对所有菌株转化合成CLA能力检测得知,45株茵具有合成CLA的能力(其中43株菌分离自泡菜)。其中菌株Ip15合成CLA能力最高,在添加O.1 mg/ml LA,1％接种量,30℃静置培养24 h时,CIA含量为26.1μg/mt,转化率达26.1％;经过细胞形态、生理生化测定、API系统以及16S Rdna分子鉴定,结果为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。
利用紫外线以及硫酸二乙酯(Diethyl sulfate,DES)对植物乳杆菌Ip15进行诱变,通过不同诱变条件与诱变致死率的关系曲线确定最佳紫外及DES诱变条件为:紫外线照射距离30 cm,紫外诱变时间20 s(致死率约70％);DES诱变浓度1％,时间30 min或者DES诱变浓度2％,时间20 min(致死率约70％)。诱变得到多株正向突变菌株,CIA的生成能力较出发菌株提高幅度在1O.7％～52.2％。其中突变菌株Ip15-2-1CLA生成能力提高幅度最大,达到52.2％,且1O次传代过程中,CLA产量基本保持稳定,表明该菌株具有较好的遗传稳定性。
不同浓度LA对菌株Ip15-2-1生长影响实验表明,该菌株能够耐受高达600lag/Ml LA,在1000μg/Ml LA浓度下依然能够生长,但受一定影响;对菌株生长细胞转化合成CLA的发酵条件进行优化,使用优化后的反应条件测定得知,在添加200μg/Ml的MRS培养液中培养48 h,CLA产量达48.7μg/Ml,添加不同浓度LA后(50、100、200、600、1000μg/Ml),CLA产量分别为12.8、26.1、48.7、141.8、72.2μg/Ml;气相色谱分析结果表明Ip15-2-1菌株产物CLA中包含两种异构体,其中异构体c9t11-CLA约占76.5％,tiocl2-CLA约占23.5％。
从植物乳杆菌Ip15-2-1中扩增得到Jlai基因,序列全长1695 bp,编码565 aa。编码序列Blast结果表明,LAI与肌球蛋白交叉反应抗原(Myosin cross.reactiveantigen,MCRA)蛋白家族成员同源性较高,而该序列与不同来源的LAI序列同源性则较低,比如与来源于红串红球菌(Rhodococcus erythropolis),嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus),罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri),短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)的LAI序列同源性分别为52.71％、27.56％、26.85％、25.9％,而与痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium aches)中的PAI序列同源性仅为11.09％。此外通过比对发现,与PAI中保守的FAD结合基序不同(GxGxxG(x)17-19E),植物乳杆菌Ip15-2-1中LAI的N端含有一个半保守的黄素腺嘌呤二核苷酸(Fiavin adenine dinucleotide,FAD)结合基序(GxGxxN(x)15K/D/E)。
从酿酒酵母K601中分别扩增了mfal信号肽序列以及α-凝集素的C-末端321个氨基酸的编码序列(sag),融合lai基因后插入酵母诱导型表达载体Pyes2中,构建了酵母展示表达载体Pyes2-mfal-lai-sag(Pymls),通过电击法转化后获得了展示表达LAI的酵母工程菌株;对酵母工程菌株不同组分的酶活测定表明LAI已成功在酵母细胞表面表达,酶活最高达到40.5 U/ml,经气相色谱检测表明,重组酵母菌株转化产物CLA中只有c9t11-CLA异构体。
将从乳酸乳球菌中扩增得到的usp45信号肽序列和lai基因以及来源于化脓性链球菌的M6蛋白锚定区序列(m6)融合后,插入到乳酸菌表达载体pMG36e中,构建了乳酸菌展示表达载体pMG36e-usp45-lai-m6(Pmulm),通过电转化植物乳杆菌Ip15-2-1,成功的获得了展示有LAI的植物乳杆菌工程菌株。植物乳杆菌工程菌株酶活力最高达到417.1 U/ml,CLA最高产量为2.09 mg/ml。转化率达到69.7％。