目的:颅骨锁骨发育不良综合征(Cleidocranial dysplasia,OMIM:119600),简称CCD,是一种罕见的先天性常染色体显性遗传的骨骼发育异常疾病,发病率约1/1000000,大量研究发现接近2/3 CCD的发生和RUNX2基因突变有关,但尚有一部分患者其致病机制尚不明确。因此,本研究旨在找到新的基因突变,并通过一系列实验来探究其发病机制,扩展CCD疾病的遗传学数据库,为不久的将来在疾病的诊断及孕妇的产前检查方面提供参考依据。方法:1.采集患者的临床资料经天津医科大学口腔医院伦理委员会的批准,患者/监护人签署参与研究的知情同意书。收集临床发现的CCD家系患病成员的临床资料,填写口腔及全身健康状况检查表,绘制家系图谱。拍摄口内像、面像照等。采取先证者、有同样表型母亲及正常对照者的外周静脉全血约4ml于EDTA真空抗凝管中,-80℃低温保存。2.突变基因的初步筛查与锁定全外显子测序使用安捷伦液体捕获系统(Agilent Sure Select Human All Exon V6)严格按照实验流程进行。在严格质控的前提下,对数据进行精细过滤,利用ANNOVAR软件对SNP、In Del发生的位置、突变类型、保守性和其他信息进行注释后,根据疾病特征筛选出可疑的基因突变及其信息,通过一代测序技术对其突变位点进行验证。3.突变的相关预测及功能验证3.1生物信息结构预测在NCBI上找到RUNX2对应的碱基序列及氨基酸序列,使用Protean、SWISS MODEL软件分别对突变型及野生型蛋白结构进行预测,分析突变对蛋白结构的影响,为下一步实验明确方向。3.2 RT-PCR直接测序技术对突变位点进行验证对提取的c DNA,利用Primer3Plus软件设计双向引物后行PCR测序实验对突变位点进行验证。3.3实时荧光定量PCR反应(q RT-PCR)利用q RT-PCR定量测定外周静脉血中RUNX2及其下游基因IBSP的c DNA相对表达量。探讨该新发突变对RUNX2功能的影响。结果:1.该国人CCD家系中共有5名患者。口内检查发现先证者仅四颗第一恒磨牙、两颗下前牙及右下第二恒磨牙部分萌出,未见其余恒牙。拍摄曲面断层片后显示:先证者口内多数乳牙滞留,恒牙埋伏阻生,并可见20余颗多生牙存在。全身情况检查发现,先证者具有典型的CCD特征,包括:身材矮小、囟门延迟闭合、前额突出、眼距增宽、鼻梁塌陷、上颌后缩/下颌前伸、右侧锁骨发育不全、脊柱侧凸等。2.全外显子测序发现一发生在RUNX2基因上的新发剪接位点突变(NM＿001015051:exon5:c.581-9 T>G),一代测序证实在第581-9位置处的胸腺嘧啶突变为鸟嘌呤。3.利用Protean软件对突变型蛋白的二级结构进行预测,较野生型,突变型RUNX2蛋白在第200位氨基酸的位置处多出一段α螺旋结构。利用SWISS MODEL软件对突变型RUNX2蛋白的三维结构进行预测,结果显示:较野生型相比,突变型RUNX2蛋白明显缩短。4.RT-PCR测序技术进一步验证了该突变的存在,该新发剪接位点的突变造成5号外显子的起始端插入了8个bp(ATCTGCAG)。5.q RT-PCR结果显示,在人静脉血中RUNX2基因的表达量相对下调,IBSP基因的表达量相对上调。结论:1.全外显子测序结果显示先证者及其母亲存在一共有的RUNX2基因新发剪接位点突变(NM＿001015051:c.581-9 T>G),一代测序证实该突变的存在。2.生物信息软件对突变RUNX2蛋白结构进行预测,发现该新发突变使得终止密码子提前出现,造成RUNX2蛋白截短及α-螺旋结构改变,影响了RUNX2蛋白正常结构。RT-PCR直接测序技术进一步验证突变造成了5号外显子起始端8bp(ATCTGCAG)的插入。3.q RT-PCR结果显示在先证者静脉血中RUNX2基因表达量相对下调,IBSP基因表达量相对上调。提示该新发剪接位点突变对RUNX2的功能造成了一定影响,证实RUNX2新发突变和该家系CCD的发生有密切联系。本结果扩展了RUNX2基因突变谱。