论文部分内容阅读
燃料乙醇己被公定为最具发展前景的可再生清洁能源之一。随着各国对环保问题的重视以及对循环能源需求的增加,生物燃料乙醇市场需求越来越大。但是目前木质纤维水解液的己糖、戊糖同步厌氧乙醇发酵技术仍然未能取得重大的突破,距离实际的工业生产还有相当大的差距。而已获得的一些有效的重组菌株存在许多缺陷仍需研究。。针对木糖发酵生产存在的问题,本次研究期望从样品中能够筛选出对温度、PH、盐度、乙醇耐受性高的木糖代谢菌株。并进一步研究四川省酒醅中木糖代谢真核微生物的多样性,为进一步改造成工业生产菌种提供优良的菌种资源。本实验采自四川省八个地区14家白酒厂的酒醅作为样品,并从中分离纯化104株代谢木糖真核微生物菌株。在各采样点中挑选菌落和菌体形态不一菌株,共计23株,对上述代表菌株进行形态观察和生理生化鉴定。初步鉴定有藿香假丝酵母(Candida rugosa)、近邹褶假丝菌(Candida pararugosa)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、季也蒙毕赤酵母(Meyerozyma guilliermondii)、盔形毕赤酵母(Pichia manshurica)、挪威毕赤酵母(Pichia norvegensis)和库德毕赤酵母(Pichia kudriavzevii)。通过26S rDNA D1/D2区域对95株菌株进行分子鉴定,在分子生物学水平上鉴别菌种,在NCBI比对该95株菌株,扩增目的片段与GeneBank上报道的菌株26S rDNA近5’端的D1/D2区域的同源性达到99%以上,初步鉴定共7个属11个种,分别为藿香假丝酵母(C.rugosa)、近邹褶假丝菌(C.pararugosa)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、异常汉逊氏酵母(Hansenula anomala)、中国布勒弹孢酵母(Hannaella sinensis)、汉逊德巴利酵母(D. hansenii)、德尔布有孢圆酵母(Torulaspora delbrueckii)、季也蒙毕赤酵母(M.guilliermondii)、库德毕赤酵母(P. kudriavzevii)、盔形毕赤酵母(P. manshurica)和挪威毕赤酵母(P.norvegensis)。本次分离纯化菌株中分离的盔形毕赤酵母(P. manshurica)和藿香假丝酵母(C. rugosa)菌株数最多,分别为22株和19株；其次就是季也蒙毕赤酵母(Mguilliermondii)为14株；中国布勒弹孢酵母(H.sinensis)和德尔布有孢圆酵母(T.delbrueckii)最少,各只有一株。地区中射洪分离的代谢木糖微生物种属最多为7种,物种多样性较较其他地区丰富。藿香假丝酵母(C. rugosa)和库德毕赤酵母(P. kudriavzevii)在4个地区中都分离出来,为分布最广,其他种属基本都是从一个地区分离出来。从26S rDNA测序结果中选取同一个地方不同种菌株和不同地方同种菌株共40株,进行ITS克隆并测序,进一步确认菌株种属。并利用MEGA5.0系统建立系统发育树,初步分析了代表菌株之间的系统演化关系,实验结果可知40株菌株被分成2大分支,说明它们在ITS区域水平上可能存在较大区别。本次实验采用微卫星DNA标记法,引物为M13和(GTG)。。对其中的75株菌株进行M13、(GTG)。指纹图谱分析,进一步研究分离出来的菌株的遗传多样性。M13和(GTG)。指纹图谱结果显示较为一致,二者显示的资源相似度和遗传距离较为相近；M13、(GTG)。指纹图谱分别在62%、60%相似度的情况下,显示4个亚支；在72%、78%相似度的情况下,显示出11个分支。酒醅中菌株优势种群比较集中在两大类中。从结果中可以看出M13在本次试验中分辨度较(GTG)5大,更能分辨出所分离出来的菌株之间的差异。研究菌株的温度、盐度、PH、乙醇耐受性。结果表明藿香假丝酵母(C ruqosa)、库德毕赤酵母(P. Kudriarzevii)、热带假丝酵母(C. tropicalis)、挪威毕赤酵母(P.norveqenis)这四种菌种对温度的耐受性较强。藿香假丝酵母(C.ruqosa)、热带假丝酵母(C.tropicalis)、中国布勒弹孢酵母(H.sinensis)、近邹褶假丝菌近邹褶假丝菌(C. pararugosa)、异常汉逊氏酵母(H.anomala)耐盐度较高。库德毕赤酵母(P. Kudriarzevii)的耐酸性较强。异常汉逊氏酵母(H.anomala)和库德毕赤酵母(P. Kudriarzevii)的耐乙醇能力较强。热带假丝酵母(C. tropicalis)和库德毕赤酵母(P. Kudriarzevii)在以木糖为唯一碳源的SC木糖液体培养基上生长最快。经实验筛选,四川省酒醅中库德毕赤酵母(P. kudriavzevii)在高温、高盐、强酸条件下和以木糖为唯一碳源的SC木糖液体培养基上生长较其他分离出来的菌株更能适应,更有较强的耐受力。为今后研究提供了良好的菌种资源。