Wnt/β-catenin信号通路对bFGF维持人根尖牙乳头干细胞干性影响的初步研究

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目的:基于前期实验基础上,通过阻断Wnt/β-catenin信号通路后,观察碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)对人根尖牙乳头干细胞(stem cells from the apical papilla,SCAP)增殖、成骨成脂分化及部分干细胞基因表达的影响。初步探讨Wnt/β-catenin信号通路在bFGF维持SCAP干性中发挥的作用。  方法:实验分为四个部分,第一部分:细胞的获得及初步鉴定。将获取的人根尖牙乳头通过酶消化法及有限稀释法克隆化培养SCAP,采用免疫荧光染色法检测间充质干细胞标志物STRO-1、CD24、波形丝及角蛋白的表达情况,对细胞进行成骨/成脂诱导4 w,茜素红/油红O染色以初步鉴定SCAP的多向分化能力;第二部分:阻断Wnt/β-catenin信号通路后,采用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)、CCK-8检测bFGF对SCAP增殖的影响;第三部分:阻断Wnt/β-catenin信号通路对bFGF作用于SCAP分化的影响,通过实时定量聚合酶链式反应(Real-Time quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR)检测bFGF在体外成骨/成脂诱导下对矿化标记基因DSPP、ALP、OCN、BSP及成脂标记基因PPAR-γ2的表达影响,并进行简单的成骨/成脂染色比较;第四部分:阻断Wnt/β-catenin信号通路后,RT-qPCR检测在bFGF作用下, SCAP中部分干细胞基因:Nanog、Oct4、Sox2、Rex1的表达情况。  本实验相关实验数据结果均采用SPSS18.0数据统计分析软件统计分析。  结果:成功获得体外培养的原代 SCAP,镜下可见细胞呈集落生长,梭形贴壁,胞浆丰富,免疫荧光染色显示 STRO-1、CD24及波形丝抗体染色细胞胞浆呈阳性,角蛋白抗体染色胞浆呈阴性,胞核均为DAPI染色;经诱导分化后细胞内显示有矿化小节/脂滴形成,具备多向分化能力。采用阻断剂DKK-1阻断 Wnt/β-catenin信号通路后,流式细胞术检测细胞增殖周期结果显示:在bFGF作用下SCAP处于DNA合成期的细胞所占比例与对照组(不加bFGF)比较无统计学差异(P>0.05);CCK-8法测得两组细胞在1,3,5,7 d的细胞增殖活力均无明显差异(P>0.05);阻断SCAP的通路后进行bFGF+成骨/成脂诱导,1 w后实验组的DSPP、OCN及BSP的表达高于对照组(P<0.05),而ALP与PPAR-γ2的表达与对照组比较无明显差异(P>0.05),体外染色镜下显示无明显差异;bFGF作用于SCAP2 d后RT-qPCR结果显示Oct4、Nanog、Sox2的基因表达均低于对照组且具有统计学意义,Rex1的表达与对照组无统计学差异。  结论:阻断Wnt/β-catenin信号通路可抑制bFGF对SCAP的增殖作用,提高部分成牙本质细胞相关基因DSPP、BSP及OCN的表达并降低部分干细胞相关基因Nanog、Oct4及Sox2的表达,说明在bFGF作用SCAP维持其干性的过程中,Wnt/β-catenin信号通路参与了bFGF对SCAP增殖及成牙本质分化影响的调控。
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