目的：接触脑脊液的神经元(简称触液神经元),是脑内一种特殊类型的神经元,其特殊性在于其构成了跨越脑-脑脊液屏障结构、通过吸收或释放某些神经活性物质而在脑-脑脊液之间实现信息传递的结构基础。依据其胞体与室管膜的位置可将触液神经元分三种:室管膜内触液神经元,胞体位于脑室壁和脊髓中央管;室管膜上神经细胞,下临室管膜;远位触液神经元(dCSF-CN),其胞体位于脑实质、突起伸入脑室腔的脑脊液中;前两种距离脑室壁近易被标记故研究较多,然而,不使用特殊方法很难将dCSF-CN和脑实质内其他非触液神经元区分,故国内外研究甚少。本实验室近二十年来的研究表明,我们采用多种形态学技术标记并首次证实,dCSF-CN在脑内大多部位只有零星散在分布,而在脑的特定部位(中脑导水管周围腹侧面)却存在着高度聚集、成簇分布、境界分明的接触脑脊液神经细胞团,我们称之为“触液核”。这一新核团的发现,及其在神经调节或神经内分泌调节中的重要作用、可能的功能意义此前未见任何报道,因此有研究之必要。　　 临床上各种病理性疼痛严重影响人们的生活质量并造成了巨大的财政与精神负担;深入研究病理性疼痛的产生、发展和维持的机制是研发理想镇痛药物或治疗手段的必由之路。长期使用吗啡治疗各种慢性疼痛会引起潜在的副作用之一——吗啡依赖且心瘾难治,原因仍在于机制不清、临床缺乏有效手段和药物。众多资料显示,神经活性物质SP在病理性疼痛、吗啡依赖/戒断中起重要作用,但SP在触液核内的表达此前并不清楚。　　 本研究以大鼠触液核参与病理性疼痛、药物依赖/戒断作为切入点,考察了触液核内P物质参与病理性疼痛、吗啡依赖/戒断的调节;并创新应用霍乱毒素亚单位B-皂草素交联复合物(CB-SAP)靶向毁损触液神经元技术、特异性地毁损触液神经元系统,建立了触液神经元系统缺失的动物模型,系统考察了缺失触液神经元系统前/后机体对于病理性疼痛、药物依赖/戒断刺激的整体行为学变化。研究结果为触液神经元系统经脑-脑脊液通路实现机体生命活动的调节积累了资料,有助于为上述疾病的诊断与治疗提供新思路。　　 材料与方法：　　 一、触液核的标记、靶向毁损　　 (一)动物雄性SD大鼠(SPF级,270g-290g);所有实验均得到徐州医学院实验动物伦理委员会的许可。　　 (二)实验分组A组(侧脑室注射CB-SAP0.5μg,2μl,靶向毁损组),B组(侧脑室注射SAP0.5μg,2μl,非特异性毁损对照组),C组(侧脑室注射CB0.5μg,2μl,假手术对照组);(n=6)。　　 (三)侧脑室注射靶向毁损剂、逆行示踪标记触液核1％戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后,立体定位(Brega:-1.2 mm±0.4mm,deep:3.2 mm±0.4 mm,Right to median sagittal plane:1.4 mm±0.2 mm),经侧脑室注射上述各分组药物各2μl;动物静养6天后,检测疼痛行为学并灌注固定、取材,免疫荧光技术标记触液核。　　 (四)Fluoro-Jade C变性触液神经元染色法经侧脑室注射CB-SAP,并用Fluoro-Jade C变性神经元染色法与激光共聚焦显微镜技术相结合行共定位分析,观测其毁损效果。　　 (五)行为影响行痛阈检测,采用电子VonFrey测定机械缩足阈值(Paw Withdrawal Threshold,PWT);采用Hargreaves热痛敏仪测定热缩足潜伏期(Thermal Withdrawal Latency,TWL)。　　 二、触液核内P物质参与病理性疼痛的实验研究(以颌面部急性福尔马林痛为例进行考察)　　 (一)实验动物雄性SD大鼠(SPF级,290g-310g),由徐州医学院实验动物中心提供。　　 (二)动物分组A组(颌面部注射2.5％福尔马林50μl),B组(颌面部注射注射50μl生理盐水);(n=6)。　　 (三)侧脑室注射CB-HRP标记CSF-CN1％戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后,立体定位(Brega:-1.2 mm±0.4mm,Deep:3.2 mm±0.4 mm,Right to median sagittal plane:1.4 mm±0.2 mm),经侧脑室注射CB-HRP3μl(0.3mg/ml)追踪标记dCSF-CN,静养48h后行颌面部福尔马林试验。　　 (四)颌面部福尔马林试验预先静置于透明有机玻璃观察箱(30 cm×30 cm×30 cm)内适应10 min,按上述动物分组注射完毕后置入箱体内,全程记录大鼠抓擦注射部分及舔足的累计持续时间共45 min,每隔3 min为一观察时段,共分15时段,将抓擦注射部分及舔足累计时间(s)数作为动物疼痛行为的定量指标。　　 (五)免疫组织化学与免疫电镜技术分析观察P物质在触液核及三叉神经核内的表达。　　 (六)统计学处理与图像分析采用Microsoft Excel2003,SPSS13.0统计学软件,Image-Pro Plus Version6.0图像分析软件(Media Cybemetics,Inc.)分析免疫组化切片,并计算光密度值(IOD)。各组数据以均数±标准差表示,组内及两组均数间的比较采用t检验,P＜0.01为差异有统计学意义。　　 三、触液核内P物质参与吗啡依赖/戒断的实验研究　　 (一)实验动物雄性SD大鼠(SPF级,270-290g),由徐州医学院实验动物中心提供。　　 (二)实验分组随机分为A,B两组(n=8);B组侧脑室注射P物质拮抗剂(D-Pro2,D-Phe7,D-Trp9)-P物质(1ug,2μl),A组注射2μl人工脑脊液(对照组)。3.3吗啡依赖/戒断模型:采用连续5天剂量递增法(d1-10,10,and10 mg/kg;d2-10,10,and20 mg/kg;d3-20,20,and40 mg/kg;d4-40,40,and80 mg/kg;d5-80,80,and100 mg/kg)。　　 (三)侧脑室注射CB-HRP标记dCSF-CN在吗啡依赖模型的第4d上午,1％戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后,立体定位(Brega:-1.2 mm±0.4mm,Deep:3.2 mm±0.4 mm,Right to mediansagittalp lane:1.4 mm±0.2 mm),经侧脑室注射CB-HRP3μl(0.3mg/ml)追踪标记dCSF-CN。　　 (四)侧脑室注射(D-Pro2,D-Phe7,D-Trp9)-P物质d58:00,1％戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉成功后,在立体定位仪下B组侧脑室注射P物质拮抗剂(D-Pro2,D-Phe7,D-Trp9)-P物质(lug,2hl),A组(对照组)注射等量人工脑脊液。　　 (五)吗啡戒断评分d68:00,吗啡依赖动物放置于透明有机玻璃观察箱内适应,10:00皮下注射纳洛酮5mg/kg,观测戒断评分,时间为1 h。　　 (六)疼痛行为学观察分别于d1,d3,d5以及第6天上午11:00(纳洛酮药物催促戒断评分行为学观察后);采用电子VonFrey测定机械缩足阈值(Paw Withdrawal Threshold,PWT)评估机械痛敏;采用热痛敏仪测定热缩足潜伏期(Thermal Withdrawal Latency,TWL)评估热痛敏。　　 (七)免疫荧光分析深麻醉、灌注取材后固定,蔗糖脱水,冰冻切片、免疫荧光双标、激光共聚焦显微镜下观察拮抗组及人工脑脊液对照组大鼠触液核内SP的表达。　　 (八)统计学处理计量资料以均数士标准误表示;GraplaPad Prism v5.0软件(GraphPadSoftware,USA)进行统计学分析(t检验)及作图,计算镇痛效应曲线下面积(AUC);P＜0.05为差异有统计学意义。　　 四、靶向毁损触液核对病理性疼痛、吗啡依赖/戒断整体行为学的影响　　 (一)实验动物雄性SD大鼠(SPF级,270-290g),由徐州医学院实验动物中心提供。　　 (二)动物分组(分A,B,C,D四组)　　 1、A组福尔马林诱导的急性炎性痛试验(分2个亚组):A1组,左足底注射2％福尔马林50μl-侧脑室注射CB-SAP0.5μg/2μl,靶向毁损组;A2组,左足底注射2％福尔马林50μl-侧脑室注射CB0.5μg/2μl,对照组;(n=6)。　　 2、B组接受完全弗式佐剂(CFA)诱导的慢性炎性痛试验(分2个亚组):B1组,左足底注射CFA50μl+侧脑室注射CB-SAP0.5μg/2μl,靶向毁损组;B2组,左足底注射CFA50μl+侧脑室注射CB0.5μg/2μl,对照组;(n=6)。　　 3、C组接受坐骨神经分支高选择性结扎(spared nerve injury,SNI)诱导的神经病理性痛试验(分2个亚组):C1组,SNI+侧脑室注射CB-SAP0.5μg/2μl,靶向毁损组;C2组,SNI+侧脑室注射CB0.5μg/2μl,对照组;(n=6)。　　 4、D组(分2个亚组)考察靶向毁损触液核对吗啡躯体依赖的影响;D1组,侧脑室注射CB-SAP0.5μg/2μl,靶向毁损组;D2组,侧脑室注射CB0.5μg/2μl,对照组(n=6);吗啡依赖/戒断模型:采用连续5天剂量递增法(d1-10,10,and10 mg/kg;d2-10,10,and20 mg/kg;d3-20,20,and40 mg/kg;d4-40,40,and80 mg/kg;d5-80,80,and100mg/kg);(n=6)。　　 (三)行为学观察　　 1、福尔马林试验　　 2、PWT　　 3、TWL　　 4、吗啡依赖戒断评分(TWS)　　 (四)统计学分析计量资料以mean±SEM表示:GraphPad Prism v5.0软件(GraphPadSoftware,USA)进行统计学分析(t检验)及作图,计算镇痛效应曲线下面积(AUC);P＜0.05为差异有统计学意义。　　 实验结果：　　 一、触液核的标记、靶向毁损　　 (一)解剖学影响Fluoro-Jade C变性触液神经元染色法是一种敏感、可靠的方法,A组切片显示,Fluoro-Jade C单标呈绿色,代表变性的神经元,CB单标呈红色,代表触液神经元,双标细胞呈黄色,代表变性的触液神经元;侧脑室注射CB-SAP组。免疫荧光双标激光共聚焦显微镜镜检显示触液神经元系统完全被毁损。　　 (二)痛觉调制功能的影响靶向毁损触液核与单纯侧脑室注射CB组PWT/TWL相比较,正常生理状态下痛阈变化不明显;但侧脑室注射非特异性毁损剂SAP组明显增强痛反应;APWT/TWLL＞BPWT/TWL(n=6,P＜0.05)。　　 二、触液核内P物质参与颌面部福尔马林诱发的急性炎性痛　　 (一)颌面部福尔马林试验评分实验组动物颌面部2.5％甲醛注射后表现出明显的两个时相性,即刻出现明显的自发性疼痛行为反应如甩头退缩尖叫等;当重新置入观察箱15-30 s后出现快速地用同侧前/后爪抓擦颌面部注射区的疼痛行为,持续约3-5min;6-12min相对平静;12-42min时间段又出现明显而且集中的抓擦行为,伴跳跃和躯体震颤现象;42min后趋于平静,仅偶见抓擦行为反应。对照组生理盐水注射最初自发性注射痛行为反应过后,偶有个别的抓擦及自然的洗面行为,两组评分差异显著,有统计学意义(n=6,P＜0.05)。　　 (二)免疫组化分析两组dCSF-CN及SP能单标神经元细胞总数无差异(P＞0.05,);A组单标dCSF-CN计数少于对照组(n=4,P＜0.01);A组SP能单标神经元IOD％多于对照组(n=4,P＜0.01);A组SP表达上调。　　 三、触液核内P物质参与吗啡依赖/戒断的实验研究吗啡戒断评分(TWS)比较,A组TWS＞B组TWS,(n=8,P＜0.05);PWT/TWL时效曲线下面积比较,A组AUC＜B组AUC,(n=8,P＜0.05);触液核内SP表达比较,A组SP表达明显减弱,(n=8,P＜0.05)。　　 四、靶向毁损触液核对病理性疼痛、吗啡依赖/戒断整体行为学的影响　　 (一)A组内福尔马林试验镇痛效应曲线下面积(AUC)比较A1AUC＞A2AUC(n=6,P＜0.05)。　　 (二)B组内PWT/TWL相比较B1PWT＜B2PWT(n=6,P＜0.05),B1TWL＜B2TWL(n=6,P＜0.05);C组内PWT/TWL相比较,C1PWT＜C2PWT(n=6,P＜0.05)(三)提示靶向毁损触液核可能增强病理性疼痛状态下的机体痛反应(四)D组内TWS评分比较,D1TWS＜D2TWS,(n=6,P＜0.05)。　　 结论：　　 1、CB-SAP侧脑室注射制作触液神经元系统缺失的模式动物模型,以及联用先进的FJC变性神经元染色法,其可靠的方法学创新有助于提升触液核的功能研究;靶向毁损触液神经元对正常生理状态下的基础痛阈影响不明显。　　 2、触液核内P物质参与了颌面部福尔马林诱发的急性炎性痛;颌面部注射福尔马林2h SP在触液核及三叉神经核内的表达均上调,但触液核内SP能神经元的轴突远行投射的细节目前并不清楚,有待进一步研究。　　 3、触液核内P物质参与了吗啡依赖,SP抑制剂(D-Pro2,D-Phe7,D-Trp9)-SP能减轻吗啡戒断症状,侧脑室微量注射SP抑制剂能有效拮抗SP的活化与减少其在触液核内的表达;本研究首次证实触液核SP表达参与了吗啡躯体依赖的发展与纳洛酮药物催促戒断;这将有助于利用药理学手段,如经脑脊液途径注射SP抑制剂干预阿片依赖寻找新方法。　　 4、靶向毁损触液核对可增强病理性疼痛状态下机体对外源性刺激的痛反应,确切机制有待深入研究。　　 5、靶向毁损触液核能够减轻吗啡依赖/戒断的症状,这为触液核参与吗啡依赖/戒断增加了实验依据,研究结果有助于革新药物滥用与成瘾的诊断与治疗。