【目的】脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)是困扰医学界的一大难题。干细胞移植促进脊髓损伤后神经修复是目前研究的重点和热点。诱导型多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPS)的发现打破了此前关于干细胞分化和培养的传统观点。本研究将脐血干细胞诱导培养成iPS细胞作为种子细胞,并联合前期制备的PCL作为组织工程支架,将iPS细胞与激活态的雪旺细胞(Activated schwann cells,ASCs)联合培养在聚己内酯(Polycaprolactone,PCL)生物支架上。并建立亚急性SCI动物模型,将搭载组织工程化iPS细胞及ASCs的支架移植入亚急性脊髓损伤实验动物体内。通过Western-Blot、免疫组化染色和行为学评估等方法探讨其修复脊髓损伤的有效性,以期对临床修复脊髓损伤提供新思路和理论依据。【方法】1.将脐血单个核细胞诱导成为iPS细胞并在人胚胎干细胞培养基条件下进行培养、扩增,采用神经干细胞条件培养基进行体外诱导培养。2.系统观察人脐血源性iPS细胞(Human umbilical cord blood derived induced pluripotent stem cells,HUCB-iPS)在条件培养基下向神经细胞方向的分化率及特性。3.将制成的PCL生物支架与两种细胞一起培养,使种子细胞迁移进入组织工程支架。将含有iPS-NSCs和ASCs的PCL支架移植入大鼠脊髓损伤局部,监测移植细胞的迁移、分化和存活情况。4.应用Western-blot方法检测移植修复后损伤部位相关神经营养因子的表达水平变化。探讨组织工程化iPS细胞移植修复脊髓损伤的原理,探讨iPS细胞修复脊髓损伤与促进轴突再生的机制。【结果】1.神经干细胞的诱导:体外实验在经四种转录因子诱导iPS细胞18天后,可以看到iPS细胞克隆团较大,边缘有较为清晰的界限并与MEF细胞相隔离,而细胞呈核大浆小,较为集中、均匀的成团生长。经过iPS细胞的NANOG、SOX2、OCT4、DAPI免疫荧光染色后,可以看到iPS细胞在NANOG和OCT4染色下呈绿色,而在SOX2染色下呈红色,在DAPI染色下呈蓝色。将iPS细胞更换RHB-A细胞培养基。7天后,可以见到球状体内,细胞逐渐增殖并且球体增大,暗黄色,透光并且形态规则。经过Nestin、DAPI染色后,荧光显微镜下,神经干细胞的Nestin染色呈绿色,DAPI染色呈蓝色,细胞球大小较为均匀。2.组织学观察:细胞移植修复脊髓损伤后,HE染色显示ASCs联合iPS-NSCs共培养支架植入组的空洞减少最为明显并且显示出较大量的细胞增生和浸润,提示ASCs与组织工程化的iPS细胞联合移植可以改善SCI后局部的病理结构,促进脊髓损伤后的运动功能恢复。3.行为学评估:在大鼠后肢运动功能评价中,ASCs与iPS-NSCs共培养支架植入组的实验动物运动功能恢复最为明显,该组的BBB评分在细胞移植后第8周可以达到12分以上。4.神经营养因子和炎性因子表达:细胞移植8周后,应用Western-blot检测NT3、GDNF、NGF等神经营养因子及炎性因子的表达。结果显示第八周细胞移植组脊髓的NT3表达相比脊髓损伤组差异不具有统计学意义(P>0.05)。结果显示第八周细胞移植组脊髓GDNF和NGF的表达相比脊髓损伤组要高,差异具有统计学意义(P<0.05)。【结论】本实验从脐血单个核细胞中诱导出人源性的iPS细胞,并将iPS细胞向神经干细胞方向诱导成功,成功地避开了长期以来争论不休的伦理问题,突破了核移植技术缺乏卵母细胞的窘境。探讨了激活态雪旺细胞分泌细胞因子作用下两种细胞与PCL支架的生物相容性及其移植治疗脊髓损伤的原理,揭示移植细胞在脊髓损伤局部微环境影响下命运决定和促进神经再生机制,为脊髓损伤的修复提供理论依据。