肝症是我国常见癌症之一,每年死于肝癌的患者约11万人,占全世界肝癌死亡人数的45%。病因目前尚未完全明了,可能是环境因素、病毒感染、食源性污染、肝炎癌变及免疫功能下降等综合作用的结果。由于发病机理多种多样,防治很难一蹴而就。目前治疗肝癌大多采用化学合成药物,在治疗过程中易产生毒副作用和多药耐药性。天然药物以其毒副作用低和不产生耐药性而引起研究者的高度关注。因此,筛选天然来源的肝癌药物成为药理学领域的研究热点。甘肃棘豆是棘豆属有毒植物品种之一,其分布面积广,营养价值高,但毒性也很强,严重威胁着草原畜牧业的发展。目前,棘豆属植物的防除和综合利用研究已取得了显著的成效。但其药用研究不深入也不系统,本试验以甘肃棘豆生物碱部位为研究对象,选择了较为常见的小鼠移植性肝癌H22和人原发性肝癌QGY-7703两种细胞株,分别进行体内外抗肿瘤作用及其机制方面的研究,获得以下结果:(1)生物碱分别用阳离子交换树脂和碱性环境溶剂提取法得到,采用碘化铋钾、硅钨酸和磷钼酸试剂进行生物碱定性检测,结果显示,所提生物碱部位沉淀反应显强阳性;出碱率碱性环境溶剂提取法(1.75%)高于阳离子交换树脂提取法(1.56%)。(2)研究甘肃棘豆生物碱对小鼠移植性H22肝癌的影响。结果表明,甘肃棘豆生物碱低、中、高剂量组(0.25、0.5、1.0 g/kg体重)均可抑制小鼠实体型与腹水型肝癌的生长,抑瘤率和生命延长率分别为38.6%、43.2%、53.8%和45.1%、55.1%、59.4%。表明甘肃棘豆生物碱具有抑制小鼠移植性肿瘤H22生长的作用。(3)对实体瘤小鼠瘤块进行肉眼观察发现,甘肃棘豆生物碱各剂量组小鼠肿瘤易于剥离,体积较小,紧实,血管不丰富。用高剂量组瘤块制备肿瘤病理切片镜检发现,甘肃棘豆生物碱抑制了肿瘤细胞的生长,部分细胞呈现坏死表现如核固缩、碎裂和溶解。(4)免疫组化SP染色结果表明,甘肃棘豆生物碱干预了增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和抑制肿瘤基因p53蛋白的表达,说明其抗肿瘤作用机理之一在于干预了肿瘤细胞的增殖能力和增殖周期。(5)甘肃棘豆生物碱高剂量组实体瘤小鼠肝、肾眼观色泽质地均正常,无病理学改变。病理切片镜检发现肝、肾细胞排列紧凑,结构清楚。表明甘肃棘豆生物碱剂量达到1.0 g/kg体重时不会引起小鼠毒性反应。(6)对实体瘤小鼠免疫器官胸腺和脾脏指数进行分析,并用放免法测定肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)和白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)的浓度。结果发现甘肃棘豆生物碱各剂量组均可提高小鼠胸腺指数和脾脏指数以及血清中TNF和IL-2的含量。表明甘肃棘豆生物碱抗肝癌作用与其改善免疫功能有关。(7)细胞毒性试验表明甘肃棘豆生物碱作用48h可显著抑制体外培养的人肝癌QGY-7703细胞的生长,剂量-效应呈正相关,相关系数为0.9886,半数抑制浓度(50% inhibiting concentration,IC50)为18.53μg/mL。但其对人外周血单核细胞抑制作用较弱,表明甘肃棘豆生物碱对细胞具有选择性,能特异性杀死肿瘤细胞。集落形成试验表明甘肃棘豆生物碱能显著降低QGY-7703细胞的增殖能力,且呈剂量-效应正相关性,相关系数是0.9929,IC50值为19.85μg/mL。(8)细胞形态学观察和DNA片段化分析证实甘肃棘豆生物碱诱导QGY-7703细胞发生了凋亡,细胞出现皱缩、变圆,核染色质固缩、碎裂、边集,形成凋亡小体和DNA梯形带等明显的凋亡特征。乳酸脱氢酶活力测定表明甘肃棘豆生物碱作用QGY-7703细胞48h内,细胞主要经历了凋亡性的死亡方式。流式细胞仪检测结果证实了甘肃棘豆生物碱可诱导QGY-7703细胞凋亡。(9)黏附抑制试验结果显示:甘肃棘豆生物碱部位不同剂量的处理组中,以高剂量组(100μg/mL)对细胞与胶原的黏附抑制作用最强,各组与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。Boyden小室体外QGY-7703细胞的侵袭、迁移试验发现,不同浓度的甘肃棘豆生物碱处理细胞后,对QGY-7703肿瘤细胞株的迁移和侵袭能力与对照组相比均有不同程度的降低,呈一定的剂量依赖性,其中,以100μg/mL组对肿瘤细胞的侵袭能力、迁移能力的抑制作用最强,侵袭抑制率为37.83%,迁移抑制率为33.97%,提示甘肃棘豆生物碱对肿瘤的抑制作用不仅表现在抑制肿瘤细胞的生长和诱导细胞调亡,还能影响肿瘤细胞与基质的相互作用,从而抑制肿瘤的浸润转移。(10)Western免疫印迹实验发现甘肃棘豆生物碱下调了B细胞淋巴瘤-2(b-cell lymphoma gene 2,bcl-2)和PCNA的表达量,而凋亡活化基因bax与肿瘤抑制基因p53的表达量增高。说明甘肃棘豆生物碱诱导的凋亡与bcl-2家族、p53和PCNA基因调控有关。本试验多角度较系统地研究了甘肃棘豆生物碱抗肝癌的作用,并从甘肃棘豆生物碱改善机体免疫功能、诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤的浸润转移等多方面探讨了其抗肿瘤的作用机制,为开发甘肃棘豆为新型天然抗癌药物奠定了理论基础。