研究背景:心肌梗死等缺血性心脏病发生后，由于心肌组织缺血缺氧导致心肌细胞的凋亡或坏死、瘢痕形成以及心室重构，最终导致心力衰竭的发生，已成为心血管疾病致残和致死的首要原因。如何使丢失的心肌在数量及功能上得到补偿是心血管病基础和临床研究的一个热门课题。近年来，人们试图向受损局部移植有功能的细胞以使丢失的心肌得到补偿。目前用于研究的替代细胞主要有：胎儿心肌细胞、成年心肌细胞、骨骼肌细胞及胚胎干细胞等，但这些替代细胞因来源不足或存在伦理学问题等而受到一定限制。骨髓间充质干细胞(BoneMarrowMesenchymalStemCells，BMSCs)是骨髓中除造血干细胞以外的另一类干细胞，近年来研究表明BMSCs具有高度自我更新能力和多向分化潜能、同时可促进血管新生、自体细胞移植时无免疫排斥反应、不存在伦理问题，加之BMSCs来源丰富、易于获取，已成为较上述细胞更为理想的组织替代细胞，在移植治疗心肌梗死上显示了良好的应用前景。 大量研究表明，BMSCs在一定条件下可诱导分化为心肌细胞(Cardiomyocytes，CM)及血管内皮细胞，目前关于其分化的机制尚未明确，主要认为是环境诱导分化的结果，即能依赖于环境而向所处环境中的特定细胞分化，其中细胞接触是主要的微环境因素，其具体机制需要进一步研究，而如何有效地诱导BMSCs分化为有功能的心肌细胞也是值得研究的课题。目前关于BMSCs体外诱导分化的研究主要集中在正常生理状态下心肌微环境对BMSCs分化的影响，而将来BMSCs移植是用在心血管疾病的治疗上，因此在病理模型上进行研究是非常必要的。最近许多关于细胞移植的研究表明，BMSCs在移植的心脏内可以生存、增殖并分化为心肌细胞，对心肌损伤的修复特别是心脏功能的改善有显著的作用。但是，内源的BMSCs在心肌梗死后能否向心肌迁移、归巢并分化还有待研究。 研究目的观察心肌细胞共培养微环境对BMSCs向CM分化的诱导作用，探讨不同细胞接触条件、凋亡刺激等对分化过程的影响及相关机制；建立骨髓重建模型，探讨内源的BMSCs在心肌梗死后向心肌的归巢及分化，为BMSCs移植治疗心肌梗死的临床应用提供实验理论依据。 方法与结果1.细胞接触诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化及其机制的研究首先，分离培养表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因Wistar大鼠的BMSCs(GFP-BMSCs)和新生SD大鼠的CM，将不同比例(1∶1、1∶10、1∶20、1∶40)的GFP-BMSCs与CM共培养1w，分别采用免疫荧光染色法及流式细胞计数分析检测GFP-BMSCs中心肌特异性蛋白TroponinI、α-sarcomericactinin和MEF-2C的表达，采用膜片钳技术检测分化细胞的电生理功能，观察不同比例条件下，细胞接触对BMSCs分化为CM的诱导作用。为了鉴定细胞融合与转分化在BMSCs分化机制中的作用，采用直接细胞接触实验，即用不同比例(1∶1、1∶10、1∶20、1∶40)的GFP-BMSCs与DiI荧光标记的CM共培养1w，采用免疫荧光染色法检测心肌特异性蛋白TroponinI，观察GFP、DiI、TroponinI在细胞中的表达情况。为了证实直接细胞接触及细胞融合在BMSCs分化中的作用，将GFP-BMSCs及CM分别接种在不同孔径的细胞培养薄膜(0.45μm、8.0μm)的上下面，共培养1w，采用免疫荧光染色法检测心肌特异性蛋白TroponinI的表达。 结果显示，在共培养条件下，GFP-BMSCs可表达一系列心肌表面标记物：TroponinI、α-sarcomericactinin和MEF-2C蛋白，GFP-BMSCs与CM同步搏动，并具有与CM相似的膜电位，表明与CM接触可诱导BMSCs获得有功能的心肌分化表型。不同比例的GFP-BMSCs与CM(1∶1、1∶10、1∶20和1∶40)获得的心肌分化表型的数量不同，免疫荧光染色及流式细胞计数结果均显示具有心肌分化表型的GFP-BMSCs的数量与CM数量呈浓度依赖性(P＜0.05)。直接细胞接触实验结果显示，部分BMSCs呈现GFP、TroponinI和DiI三阳性，表明BMSCs与CM融合获得心肌分化表型；部分BMSCs只呈现GFP和TroponinI文阳性，表明BMSCs转分化为心肌细胞而获得心肌分化表型。细胞培养薄膜实验结果显示，在孔径为8.0μm的细胞培养薄膜上培养的细胞，部分BMSCs呈GFP、TroponinI和PI三阳性，而在孔径为0.45μm的细胞培养薄膜上培养的细胞，没有发现三阳性的细胞，表明BMSCs通过孔径大的细胞培养薄膜与CM形成直接细胞接触时才可获得心肌分化表型。 2.体外TNF-α诱导心肌凋亡对BMSCs获得心肌分化表型的影响为了观察病理状态下心肌微环境对BMSCs分化的影响，本实验通过TNF-α诱导CM凋亡后，采用DiI标记凋亡的CM，以不同比例(1∶1、10∶1、20∶1、40∶1)与GFP-BMSCs共培养1w，细胞凋亡的比率采用DAPI染色鉴定，并采用免疫荧光染色检测心肌特异性蛋白TroponinI的表达。 DAPI染色结果显示正常培养的心肌细胞可检测到少量凋亡的细胞核，约22.60％±0.88％，而TNF-α诱导凋亡组的凋亡细胞核明显增多，约47.92％±1.97％(P＜0.05)。免疫荧光染色结果显示，凋亡组与对照组均可见GFP、DiI及TroponinI三阳性的细胞；不同比例的GFP-BMSCs和CM(1∶1、1∶10、1∶20和1∶40)共培养时，凋亡组中呈三阳性的细胞比对照组明显增加(P＜0.05)，表明TNF-α诱导的心肌细胞凋亡可刺激BMSCs向心肌细胞分化。 3.心肌梗死后内源的BMSCs在心肌组织中的迁移、归巢和分化为了进一步探讨内源的BMSCs在心肌梗死后的迁移、归巢以及分化情况，本实验在成功建立小鼠骨髓重建模型的基础上，于骨髓重建4w后行冠状动脉左前降支(LAD)结扎术建立小鼠急性心肌梗死模型(n=4)，1w后处死，对照组为单纯骨髓重建小鼠(n=3)，于骨髓重建4w后处死。取心脏组织，采用免疫荧光染色检测心肌特异性蛋白TroponinI的表达，观察心肌梗死后GFP-BMSCs的在心肌组织中的分布、分化。 心肌组织切片免疫荧光染色结果显示，骨髓重建小鼠心肌梗死组与对照组均可见到发绿色荧光的GFP-BMSCs，其数量在心肌梗死组比对照组明显增多。两组切片均可见部分BMSCs呈GFP、TroponinI和PI三阳性，在心肌梗死组可见三阳性的细胞比对照组明显增多，表明心肌梗死后BMSCs能迁移、归巢到受损的心肌组织并获得心肌分化表型。 结论1.心肌细胞接触可诱导BMSCs向有功能的心肌细胞分化，分化细胞的数量与心肌细胞的数量呈浓度依赖性，其分化机制涉及细胞融合与转分化的共同作用，直接细胞接触是BMSCs获得心肌分化表型的关键微环境因素。 2.TNF-α诱导的心肌细胞凋亡可促进BMSCs向心肌细胞分化。 3.心肌梗死后内源的BMSCs能迁移、归巢到受损的心肌组织并向心肌细胞分化。