论文部分内容阅读
Claudins(CLDNs)是构成上皮和内皮细胞之间紧密连接(TJs)的基本结构,也是维持细胞之间TJs功能的一类骨架蛋白。CLDNs表达异常在肿瘤发生、发展及转移过程中发挥非常重要的作用。其中,Claudin6(CLDN6)是27个紧密连接蛋白CLDNs家族成员之一,具有4个跨膜区,位于细胞浆内的羧基末端具有PDZ结合结构域,可与信号蛋白和细胞骨架蛋白结合,参与细胞对外界信号的应答及细胞内的信号传递过程。CLDNs表达异常导致TJs功能改变,促进肿瘤细胞迁移及侵袭。本课题组前期工作中发现,在乳腺癌细胞及组织中CLDN6表达下调;过表达CLDN6显著抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。课题组预实验结果表明,过表达CLDN6后乳腺癌细胞内纤维状肌动蛋白(F-actin)微丝大量解聚,细胞边缘伪足较少(鬼笔环肽荧光染色);在胞膜、胞核及核周观察到大量细胞骨架分布(透射电镜)。由此我们认为,CLDN6抑制细胞迁移及侵袭与细胞骨架重排有关。细胞骨架最重要的作用是维持细胞形态和结构,参与细胞的运动。分布在细胞伪足中的纤维状肌动蛋白(F-actin)通过解离与聚合作用控制着细胞伪足的收缩,进而调控细胞的运动。在肿瘤细胞转移过程中,微丝不断聚合、解聚及重排的滚动式循环过程驱动肿瘤细胞迁移。研究表明,有多种信号通路参与调控细胞骨架影响肿瘤细胞迁移及侵袭。其中,IL-8是一种CXC型炎性趋化因子,目前被报道参与调控细胞骨架。IL-8与受体CXCR2结合,通过整合素激活Rho GTP酶上调粘着斑激酶(FAK)酪氨酸残基磷酸化表达水平,激活皮层蛋白(Cortactin)磷酸化募集Arp2/3复合体调控F-actin聚合,导致细胞骨架重排影响迁移及侵袭。综上,IL-8/CXCR2信号通路通过整合素激活FAK磷酸化调控F-actin聚合导致细胞骨架重排影响迁移及侵袭。IL-8作为趋化因子受多种信号分子调控,研究表明,CLDNs通过PDZ结构域与闭合小环蛋白1(ZO-1)结合,在肿瘤细胞转移过程中发挥信号传递的作用。ZO-1是紧密连接相关蛋白,参与调节细胞物质转运及维持上皮细胞极性,ZO-1与转录因子(AP-1、NF-κB)协同作用激活IL-8启动子调控IL-8在乳腺癌细胞中的表达。由此我们推测:CLDN6可能通过IL-8/CXCR2信号通路影响细胞骨架重排抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭。目的:探讨CLDN6通过调控IL-8/CXCR2信号通路抑制乳腺癌MCF-7细胞迁移和侵袭的作用机制,为靶向CLDN6的乳腺癌治疗提供一定的实验依据。方法:1.RT-PCR和Western-Blot技术鉴定过表达CLDN6的乳腺癌细胞系MCF-7(MCF7/CLDN6)中CLDN6的表达;2.RT-PCR技术检测MCF7/CLDN6细胞中IL-8表达水平;3.通过划痕实验筛选IL-8最佳作用浓度及最佳作用时间;用IL-8最佳作用浓度及最佳作用时间处理MCF7/CLDN6细胞后,进行后续实验,0.1%BSA为对照处理:4.显微镜明场观察IL-8对MCF7/CLDN6细胞形态的影响;采用鬼笔环肽荧光染色法及透射电镜技术观察MCF7/CLDN6细胞骨架变化;5.采用Transwell迁移及侵袭实验检测IL-8对MCF7/CLDN6细胞体外迁移及侵袭能力的影响;6.Western-Blot技术检测MCF7/CLDN6细胞中IL-8受体CXCR2及细胞骨架相关蛋白黏着斑激酶(FAK)、Rac1/Cdc42磷酸化的表达水平。结果:1.RT-PCR和Western-Blot技术显示,MCF7/CLDN6细胞中CLDN6表达显著高于空载组(MCF7/Vector)细胞;2.RT-PCR技术显示,与MCF7/Vector细胞相比,MCF7/CLDN6细胞中IL-8表达明显下调;3.划痕实验显示IL-8最佳作用浓度为80ng/ml,最佳作用时间为48h;用最佳作用浓度IL-8处理MCF7/CLDN6细胞48h后,进行后续实验,0.1%BSA为对照处理:4.显微镜明场观察显示,IL-8处理组呈长梭形细胞形态;对照组呈铺路石样细胞形态;5.鬼笔环肽染色实验显示,与对照组相比,IL-8处理组中,在细胞膜内侧、细胞伪足及细胞连接处F-actin荧光强度较强分布密集呈束状且排列规则;生物电镜实验显示,IL-8处理组细胞骨架微丝排列规则成束,微管结构出现且位于细胞膜下方;6.Transwell迁移和侵袭实验显示,与对照组相比,IL-8处理组细胞迁移和侵袭能力显著增强;7.Western-Blot技术显示,与对照组相比,IL-8处理组细胞中IL-8受体CXCR2及细胞骨架相关蛋白FAK、Rac1/Cdc42的磷酸化表达水平明显上调。结论:CLDN6通过下调IL-8/CXCR2信号通路调控细胞骨架重排抑制乳腺癌MCF-7细胞迁移及侵袭。