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第一部分:骨髓间充质干细胞的分离、培养、鉴定及其自身特性的初步研究目的:通过本实验,对骨髓间充质干细胞进行分离、培养、鉴定并对其自身特性加以研究,同时为下一步明胶海绵载体搭载移植实验提供搭载细胞。方法:首先,利用差速贴壁培养法将骨髓间充质干细胞从大鼠的骨髓之中分离、纯化出来。之后,利用流式细胞学方法对骨髓间充质干细胞的表面标记物加以鉴定。在鉴定其为骨髓间充质干细胞后,以C6细胞系做为对照绘制其在不同代数时期的生长曲线,对其致瘤性加以研究。利用免疫荧光学的方法,研究骨髓间充质干细胞在一定条件下自发向神经细胞转化的特性。利用Transwell方法,研究骨髓间充质干细胞可向受损神经组织定向迁移的特性。最后,研究骨髓间充质干细胞简便的冻存与复苏保存方法。结果:从大鼠骨髓腔中冲出的混杂细胞,在倒置相差显微镜下显示为大量单个或成团均匀分布的小圆形细胞。4～8小时之后部分细胞沉降并铺至培养皿底部。24小时后观察可见铺于培养皿底部的大部分细胞变扁并逐渐伸出突起。3天后未贴壁细胞及其它髓腔内物质经换液被大部分去除。此后贴壁细胞不断扩增,至10～14天可见大量细胞汇集成片,形态不一,成团生长。其中可见大扁平形、多角形、星形、梭形等多种细胞形态。经过传代细胞形态和类型逐渐趋向单一,至第5代细胞大小一致,形态呈梭形,已基本得到纯化。利用流式细胞学方法的检测,细胞体系表达表面标志物CD31、CD34、CD45为阴性,表达表面标志物CD71为阳性。对其不同时期的生长曲线与C6细胞系相比较,骨髓间充质干细胞生长曲线有很明显的压低。通过倒置相差显微镜的观察和免疫荧光学的检测,发现骨髓间充质干细胞在一定条件下可自发分化出神经样细胞并表达神经细胞标志物GFAP、NSE。通过Transwell实验,可以观察到在相同的时间内损伤组骨髓间充质干细胞穿过率明显高于对照组骨髓间充质干细胞的穿过率,经统计P<0.05有显著差异。经过简便方法冻存的骨髓间充质干细胞在-80℃条件下至少可以存活3个月,在液氮中保存则至少可以存活半年。骨髓间充质干细胞经过复苏后数量会有较大的损失,但只要复苏后存活的骨髓间充质干细胞达到一定的数量和密度,这些细胞仍可迅速扩增并在较短的时间内获得大量、稳定,可以利用的骨髓间充质干细胞。结论:通过最常应用的差速贴壁培养法可以很稳定地培养出骨髓间充质干细胞,第5代细胞已达到纯化要求。通过细胞表面标志物的鉴定可以确定其为骨髓间充质干细胞。10代以内的骨髓间充质干细胞致瘤性极小或者不存在,可以自发分化出神经元和神经胶质细胞。另外,其具有独特的归巢性可向受损的神经组织迁移。骨髓间充质干细胞通过简便的冻存与复苏方法能够在较长时间内稳定的保存,可为后续应用提供储备细胞。第二部分:骨髓间充质干细胞经明胶海绵载体搭载向神经组织移植可行性的初步研究目的:研究骨髓间充质干细胞被明胶海绵载体搭载后其存活率是否受到影响和其自身特性有否改变,并进一步研究骨髓间充质干细胞经过明胶海绵载体搭载后能否与神经细胞共存。方法:首先,观察经明胶海绵搭载后骨髓间充质干细胞形态有否改变并统计经明胶海绵搭载移植后的骨髓间充质干细胞贴壁存活的数量与未经搭载细胞相比是否有差异。然后,以未经搭载第5代骨髓间充质干细胞为对照绘制经过搭载骨髓间充质干细胞的生长曲线,并对其致瘤性加以研究。之后诱导其向神经细胞方向分化,观察经过搭载的骨髓间充质干细胞与未经搭载的细胞在诱导之后形态的不同,并统计二者所分化出的神经元比例是否有差异。最后,建立体外神经细胞培养体系,并通过倒置相差显微镜研究观察经明胶海绵搭载后的骨髓间充质干细胞能否与神经细胞共同培养。结果:倒置相差显微镜观察,明胶海绵组与对照组相比较细胞的形态未有明显变化,多呈长梭形,扁平老化的现象也很少见。无论是在明胶海绵中部或是边缘部均有骨髓间充质干细胞贴壁,而且在明胶海绵中部贴壁的细胞数量更多一些。通过对明胶海绵组和对照组未贴壁细胞的计数比较P>0.05,无统计学差异。经搭载后的第5代骨髓间充质干细胞的生长曲线与未经搭载第5代细胞的生长曲线相比较没有观察到明显的变化。骨髓间充质干细胞经诱导6～8小时后可以观察到细胞胞体开始收缩并伸出突起,部分突起相互连接形成网络状结构。经免疫荧光学检测细胞可表达神经胶质细胞标记物GFAP和神经元细胞标记物NSE。通过流式细胞学方法对明胶海绵组与对照组表达NSE阳性率做比较,经统计P>0.05,无显著差异。新生大鼠神经细胞种植后12～24小时后大部分细胞可贴壁并伸出突起。随着培养时间的延长神经元胞突主干和分枝明显延长形成稠密的网络,神经胶质细胞数量则不断增长。原代神经细胞可在体外维持培养14～30天以上。经过搭载的骨髓间充质干细胞移植入神经细胞培养体系以后,倒置相差显微镜下观察可见二者能够共同生长、繁殖。结论:骨髓间充质干细胞经过明胶海绵搭载后,细胞的贴壁、存活未受到明显影响。其低致瘤性的增殖特性以及可分化为神经细胞的特性也未有明显改变。经明胶海绵搭载移植后骨髓间充质干细胞可以与神经细胞共存。