【摘 要】
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细胞膜是生物材料和生物活性分子与细胞发生作用的第一个重要场所。深入了解多肽等生物活性分子与细胞膜之间的相互作用动力学过程,特别是研究这些活性分子对细胞膜结构和性质的干扰,对于功能性多肽的设计（包括基因和药物载体的构建,抗菌、抗病毒、抗肿瘤药物的开发等）具有重要意义。膜活性多肽主要包括细胞穿透肽和抗菌肽两类。细胞穿透肽能够携带较大的蛋白质或纳米粒子,在不造成显著细胞毒性的情况下穿过细胞膜,因此在纳米
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细胞膜是生物材料和生物活性分子与细胞发生作用的第一个重要场所。深入了解多肽等生物活性分子与细胞膜之间的相互作用动力学过程,特别是研究这些活性分子对细胞膜结构和性质的干扰,对于功能性多肽的设计（包括基因和药物载体的构建,抗菌、抗病毒、抗肿瘤药物的开发等）具有重要意义。膜活性多肽主要包括细胞穿透肽和抗菌肽两类。细胞穿透肽能够携带较大的蛋白质或纳米粒子,在不造成显著细胞毒性的情况下穿过细胞膜,因此在纳米载体研究领域吸引了广泛关注;天然抗菌肽通过直接破坏细菌的细胞膜杀死细菌,且不容易产生耐药性,因此探究抗菌肽的细胞膜作用机制从而发展高效抗菌药物被认为是对抗耐药细菌（包括耐多药“超级细菌”）威胁的重要途径。由于细胞膜的高度复杂性,在相关研究中有必要利用理想化的模型膜系统,结合适当的实验技术,对细胞膜的不同方面进行研究。脂质与蛋白质（多肽）的相互作用涉及许多基本过程,因此大量不同的研究手段和技术（包括各种光谱技术、电镜技术、电化学工作站等）被广泛使用。对于实时监测细胞膜的各种动态过程,使用一种简单、实时的技术结合合适的模型膜系统将会很有帮助。其中,单层巨囊泡泄漏检测技术提供了一种直观的方法来监控多肽诱导的膜透化作用;本课题组最近开发的原位界面光电压瞬态监测技术则提供了一种高灵敏、实时、非侵入性和无标记的界面过程监测手段。在此,我们结合并发展了这两种技术,研究了多肽-膜相互作用过程中的分子细节。本论文各部分的主要内容如下:（1）在第一章中,我们针对细胞膜、两类典型的膜活性多肽以及多肽-细胞膜界面作用的研究方法进行了介绍与总结,并对相关领域的研究结果与进展进行了概括分析。（2）在第二章中,我们详细介绍了本论文主要使用的研究方法,包括界面光电压瞬态实时监测法、激光扫描共聚焦显微术、单层巨囊泡泄漏动力学方法、及原子力显微术等。（3）在第三章中,我们有效结合了原位界面光电压瞬态监测技术、单层巨囊泡（以及在此基础上发展出的双层巨囊泡）泄漏实验、原子力显微镜表征等研究方法,以典型的细胞穿透肽TAT为例,探究了 TAT与模型细胞膜作用的机理,揭示了不同多肽浓度下以及不同时间阶段内多肽与膜的不同作用模式。TAT浓度为0.1和1.0 μg mL-1时,会导致膜结构快速扰动（t＜1min）,之后膜发生重组和轻微损坏,最后系统基本达到稳定（t＞10 min）。TAT浓度为10.0 μgmL-1（约6.4 μM）时,脂膜双层结构在初始扰动（t＜1 min）之后,会发生剧烈损伤（1～10 min）,直至最终达到稳定状态。单层及双层巨型囊泡泄漏实验进一步表明,在一定浓度范围内（0.1～1.0 μg mL-1）,TAT的数目与膜透化效率呈线性依赖关系。此外,相同多肽浓度下,基底固定化脂膜的染料分子跨膜扩散速率约为非基底固定化脂膜的3倍。（4）在第四章中,我们结合了原位界面光电压瞬态监测技术、单层巨囊泡泄漏实验、分子动力学模拟等研究方法,以典型的天然抗菌肽PGLa和Magainin2（MAG2）为例,探究了抗菌肽PGLa和MAG2协同作用于细胞膜的机理。二者单独与膜作用时,多肽PGLa快速、连续地在膜内插入和抽出,只产生短暂的较小的孔隙;多肽MAG2倾向于聚集在膜表面或仅浅层嵌入膜中。二者协同与膜作用时,PGLa在膜上产生瞬态结构缺陷,MAG2快速插入缺陷区域,此时会吸引周围的多肽分子与之结合形成PGLa-MAG2异质二聚体甚至异质二聚体簇。这一结构的形成导致了大尺寸稳定跨膜孔的出现,能够产生更好的膜透化效果。我们以PGLa与MAG2两种具有协同作用的多肽为例,分别介绍了两种多肽单独与膜的作用机制以及协同与膜的作用机制,揭示了协同作用机制的优越性。（5）在第五章中,我们对论文内容进行了总结,对未来的研究进行了展望。总之,本论文揭示了两类典型膜活性多肽与磷脂膜相互作用的分子机理,提供了细胞膜界面研究的一类普适性方法。本论文的结果对于新型抗菌剂的设计、以及开发用于生物医学应用的新型纳米载体具有指导意义。
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