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目的:
探讨在小鼠胚胎心内膜细胞中Calcineurin/NFATcl信号通路对FGFRl表达和胚胎心内膜细胞增殖的影响。
方法:
(1)取E11.5的小鼠胚胎,免疫组化方法检测NFATcl的阳性表达。分离并原代培养小鼠胚胎E11.5心内膜细胞(ECC)。分离的胚胎心内膜细胞(ECC)加入M199培养液,并加入20%胎牛血清(FBS),37℃传代培养,倒置显微镜观察细胞形态及生长情况。进行ECC细胞爬片,应用免疫荧光染色法鉴定。固定的ECC经PBS洗涤后,在含0.2%TritonX-100中通透10min。5%牛血清白蛋白室温封闭30min后,与一抗在4℃孵育过夜。一抗为ANTI-NFATcl。二抗为异硫氰酸荧光素标记抗体。
(2)应用CSA抑制或应用PMA+Ionomycin激活ECC细胞Calcineurin/NFATcl信号通路后来研究对FGFRl表达的影响。提取总RNA,以GAPDH为内参,进行RT-PCR反应,通过光密度扫描进行半定量分析。传代培养小鼠胚胎心内膜细胞,给予不同剂量的PMA+Ionomycin、CSA作用细胞不同时间(1、2、3、4d),CCK-8法检测不同浓度药物对小鼠胚胎心内膜细胞增殖的影响。
(3)通过PCR扩增FGFRl目的片段,双酶切纯化PCR产物及pcDNA3.1a,将扩增的FGFRl基因片段插入pcDNA3.1a线性质粒,即构建成pcDNA3.1a-FGFRl真核表达质粒,将质粒转化感受态细胞DH5a,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及测序鉴定。
结果:
(1)NFATcl通过免疫组化法在胚胎心内膜呈现定位清晰的淡黄色至棕褐色颗粒状着色。冻存细胞复苏后,增殖能力强,和传代细胞具有相似的生长特性。ECC细胞通过免疫荧光染色法显绿色荧光。
(2)应用CSA抑制ECC细胞中Calcineurin/NFATcl信号通路后FGFRl的表达下调;应用PMA+Ionomycin激活ECC细胞中Calcineurin/NFATcl信号通路后FGFRl的表达上调。CSA可显著抑制小鼠胚胎心内膜细胞的增殖,PMA+Ionomycin可显著促进小鼠胚胎心内膜细胞的增殖,并且在药物浓度和时间上呈剂量依赖性和时间依赖性关系。
(3)酶切及测序结果表明pcDNA3.1a-FGFRl真核表达质粒构建成功。
结论:
(1)NFATcl在胚胎心内膜阳性表达。小鼠胚胎心内膜细胞培养成功。本实验通过培养小鼠胚胎心内膜细胞和研究其生物学特性,为下一步的研究提供了新的细胞来源。
(2)FGFRl可能是受NFATcl调控的下游基因。NFATcl在心脏瓣膜发育中是通过正调节FGFRl而发挥作用的。CSA对小鼠胚胎心内膜细胞的增殖有显著抑制作用。PMA+Ionomycin对小鼠胚胎心内膜细胞的增殖有明显的促进作用。
(3)pcDNA3.1a-FGFRl真核表达质粒构建成功,为下一步的研究奠定了实验基础。