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【研究背景】肺动脉高压(PH)是多种病因导致的肺动脉血管床破坏，血管重构，循环阻力增加，从而导致右心压力负荷增高，进而导致右心衰竭的综合征。是多种循环、呼吸、代谢等系统疾病发生、发展的重要病理生理过程。肺动脉高压患者约75％在诊断后5年内死亡，症状出现后平均生存期约1.9年；有右心衰表现者，平均生存时间小于1年。肺动脉高压危害大，预后差。其肺血管的基本病理变化，早期以肺动脉收缩为主，后期以肺动脉重塑为主。目前，关于肺动脉高压的发病机制尚不完全清楚。研究表明，肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)内钙离子浓度（[Ca2+]i）在肺动脉高压发病过程中扮演重要的角色。细胞内Ca2+与钙调蛋白（CaM）结合，形成Ca2+-CaM复合物，该复合物结合胞质内的肌球蛋白轻链激酶（MLCK），并使之活化。活化的MLCK磷酸化粗肌丝原肌球蛋白横桥的肌球蛋白轻链（MLC），磷酸化的MLC（P-MLC）激活横桥的ATP酶，水解ATP释放能量引发肌丝滑动，导致平滑肌收缩。细胞内Ca2+还可激活钙依赖激酶（如钙调蛋白激酶，CaMK）和某些转录因子[如c-Fos，激活的T细胞的核因子(NFAT), cAMP反应元件结合蛋白(CREB)]等，促使休眠期细胞进入增殖期，引起PASMCs增殖。 细胞内钙离子浓度的升高通常通过以下途径实现：1）细胞内细胞器（如肌质网）储存钙的释放；2）细胞膜钙 ATP酶（Ca2+-ATPases）及钠钙交换体（Na+/Ca2+ exchangers）介导的细胞外液钙离子内流；3）细胞膜钙离子通道介导的细胞外液钙离子内流。目前，已经发现的细胞膜钙离子通道主要有受体操纵性钙通道（ROCCs）、电压依赖性钙通道（VDCCs）和钙池操纵性钙通道（SOCCs）。本课题组及其他学者的研究发现，在低氧诱导的[Ca2+]i升高过程中，SOCC而不是VDCC起主导作用。 泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system）是细胞内蛋白质降解的主要途径，该途径包括底物蛋白质的泛素化和蛋白酶体降解两个过程。底物蛋白质经泛素活化酶E1、泛素载体蛋白E2、泛素连接酶E3的催化作用而被多聚泛素化。多聚泛素链作为一种标签，可以被26S蛋白酶体识别，进而被26S蛋白酶体降解。研究表明，在多种疾病尤其是增生性疾病，存在蛋白酶体活性增强。作为一个新的治疗靶点26S蛋白酶体受到广泛关注。硼替佐米（BTZ）是第一个用于临床的蛋白酶体抑制剂，用于治疗多发性骨髓瘤取得了良好的疗效。近年来，有研究表明BTZ可明显缓解动物模型肺动脉高压的进展。其机制可能与上调内皮源性一氧化氮合酶（eNOS)，促进一氧化氮（NO）磷酸化，进而增加NO的合成以及上调核因子-jB抑制物(I-κBα)等有关。BTZ下调核因子-κB（NF-κB)，转化生长因子-β（TGF-β)和血管内皮生长因子（VEGF)的作用，也有助于肺动脉高压的治疗。 BTZ缓解模型动物肺动脉高压的作用是否与其调节PASMCs内钙离子稳态有关，尚未发现相关研究。本文拟通过BTZ治疗肺动脉高压的具体作用及其对细胞内钙离子稳态的影响进一步探讨BTZ治疗肺动脉高压的机制。 【研究目的】探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米（BTZ）治疗低氧及野百合碱（MCT）诱导的肺动脉高压大鼠模型的有效性及其可能的作用机制。 【研究方法】分别建立低氧和MCT诱导的大鼠肺动脉高压模型，并予BTZ干预。21天后测定大鼠右心室压力（RVP）、右心室肥厚指数[RV/(LV+S)]。4%多聚甲醛固定肺组织用于 HE染色。分离肺动脉，除去外膜及内膜组织，得到肺动脉平滑肌组织。取一部分用于培养PASMCs。24-48h待细胞贴壁后，用钙离子成像系统测定细胞内基础钙离子浓度及SOCE。另一部分提取RNA或蛋白，通过荧光定量PCR和免疫印迹法测定肺动脉HIF-1α、BMP4、PPARγ、TRPC1和 TRPC6的表达。 分离正常大鼠远端肺动脉，原代培养 PASMCs，通过 BrdU法测定不同浓度 BTZ对 PASMCs增殖的影响，并选择一合适浓度及药物作用时间进行细胞内基础钙离子浓度及SOCE的测定。并通过荧光定量PCR和免疫印迹法测定原代培养的肺动脉平滑肌细胞HIF-1α、BMP4、PPARγ、TRPC1和 TRPC6的表达情况。 【研究结果】成功建立慢性低氧诱导的肺动脉高压（CHPH）大鼠模型及MCT诱导的肺动脉高压大鼠模型（MCT-PH）。BTZ显著降低肺动脉高压大鼠模型的平均右心室压、右心室收缩压及右心室肥厚指数，减轻肺动脉血管壁增厚；BTZ在 mRNA及蛋白水平显著抑制低氧及 MCT诱导的HIF-1α，BMP4，TRPC1和 TRPC6表达上调和PPARγ表达下调；BTZ显著降低肺动脉高压模型大鼠肺动脉平滑肌细胞内基础钙离子浓度及SOCE。 在体外原代培养的肺动脉平滑肌细胞，BTZ显著抑制低氧诱导的原代肺动脉平滑肌细胞增殖，并呈剂量依赖性。BTZ在mRNA及蛋白水平显著抑制低氧诱导HIF-1α，BMP4，TRPC1和 TRPC6的表达上调和PPARγ的表达下调；BTZ显著降低低氧肺动脉平滑肌细胞内基础钙离子浓度及SOCE。 【结论】BTZ能够显著改善低氧及MCT诱导的肺动脉高压模型大鼠的血流动力学，减轻其右心室肥厚，抑制其肺动脉血管重塑。其机制可能与 BTZ下调HIF-1α，BMP4，TRPC1和 TRPC6的表达，上调PPARγ的表达；减少 SOCE,降低肺动脉平滑肌细胞内钙离子浓度；抑制肺动脉平滑肌细胞增殖有关。