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猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus PEDV)是引起猪的急性、接触性肠道传染病的主要病原体,PEDV可在猪群中持续存在,主要症状为呕吐、腹泻和脱水,各种年龄和品种的猪都易感。感染发病后引起的仔猪病死率偏高,给养猪业造成了巨大的经济损失。目前我国主要采用疫苗免疫的方法防控猪流行性腹泻(PED),但是疫苗免疫存在免疫空白期,仔猪的免疫功能不完善,易发生PED,用基因工程制备的单域抗体可以弥补这个缺陷。PEDV纤突蛋白(Spike protein S蛋白)位于病毒表面,包含病毒的多个中和表位和受体结合域,与病毒的抗原性和吸附入侵密切相关。S蛋白是目前新型基因工程疫苗和被动免疫制剂研发的主要靶点。单域抗体具有高水溶性、低免疫原性、高抗原结合活性和高稳定性等特点,作为被动免疫,效应快,不需经过潜伏期,一经输入,可立即获得免疫力,能够有效防控疾病。本试验中使用S蛋白作为筛选抗原从已构建好的噬菌体抗体库进行筛选,选取了Phage ELISA鉴定结果中对PEDV相对结合能力较强的一株阳性克隆,通过质粒重组,将单域抗体基因片段与表达载体pET-28a连接,并化学转化至原核表达细胞Transetta-DE3中,进行诱导表达和纯化,从而得到高结合活性的PEDV S蛋白特异性单域抗体,并且进行ELISA鉴定和细胞免疫荧光试验,鉴定其免疫学活性,得到以下结论:(1)特异性噬菌体抗体库得到了良好的富集,经Phage ELISA筛选后得到20个有一定结合活性的阳性克隆;(2)基因序列测定得到6株不同的单域抗体VHH序列,并提取其中一株单域抗体(S7)的质粒,克隆到原核表达载体pET-28a中,获得了重组表达质粒pET-28a-VHH,进行IPTG诱导表达并纯化后,得到无杂蛋白的单域抗体;(3)Western-Blot试验证实单域抗体具有免疫学反应性;经ELISA鉴定单域抗体可以与PEDV产生抗原抗体中和反应,并有较高的抗原结合活性;细胞免疫荧光试验证实单域抗体S7可以在细胞内与抗原产生抗原抗体结合反应。