随着现代社会竞争加剧、工作和家庭压力增大、生活节奏加快,人们用于工作、娱乐和社交的时间逐渐增多,睡眠时间逐渐减少,失眠等睡眠障碍人群不断扩大,睡睡剥夺(sleep deprivation, SD)现象越来越突出。某些特殊行业(如航空、航海、医疗、交通运输等)和在某些特殊情况(如疾病、战争、洪水和地震等)下,SD尤其是慢性睡眠剥夺(chronic sleep deprivation, CSD)的发生率更高,程度也更为严重。SD可导致认知功能障碍、警觉性和行为控制能力降低,从而导致工作效率降低,甚至由于判断和决策失误而导致严重的安全生产事故。但目前对CSD引起学习记忆及认知功能改变的机制尚不完全清楚。功能影像学的研究证明,SD导致了顶叶、前额叶、楔叶的代谢活性发生变化,应用不同药物改善这些脑区的代谢活性则可改善SD导致的认知功能障碍,表明新皮质在SD导致的神经行为学改变中同样发挥着重要作用。前额皮质(prefrontal cortex, PFC)为位于额叶前部的新皮质,参与了学习、记忆、计划、决策、注意等高级神经活动,在维持警觉性、抑制不适当的行为和情绪反应、减少决策失误方面有着不可替代的作用。因此PFC可能在SD导致的学习记忆和认知功能障碍中发挥重要的作用,为研究SD和PFC在认知功能方面的关系提供了证据。中枢神经系统内不同递质和受体可能通过调控SD导致的突触可塑性变化而影响学习记忆功能。PFC内多巴胺(dopamine, DA)主要来源于中脑腹侧被盖区,参与调节睡眠与觉醒过程及动机、认知、学习和记忆等高级神经功能。因此,SD导致PFC内DA及其受体功能紊乱可能是导致学习记忆和认知功能障碍的重要原因。DA从突触前膜释放后,通过DA受体发挥生理效应。DA受体包括D1-D5五种亚型,其中D1和D5属于D1类受体,D2、D3、D4属于D2类受体。在猴和啮齿类动物的PFC内,D1受体结合位点和受体mRNA的数量明显多于其他类型的受体,且PFC内D1受体可能具有促进学习和记忆功能的作用,故本课题侧重于CSD对DA和D1受体的影响,以及DA、D1受体在CSD导致学习记忆障碍中的作用。鉴于目前对CSD导致学习记忆障碍的分子机制研究较少,尤其是前额皮质D1受体在该过程中所发挥的作用还不清楚,所以本研究通过连续21d、每天18h的长时间间断性REM睡眠剥夺建立CSD大鼠动物模型,观察CSD对大鼠一般生理状态及学习记忆能力的影响以及对PFC细胞凋亡、超微结构、DA含量及D1受体表达水平的影响。然后给予D1受体激动剂干预,观察以上指标的改变,以阐明PFC内DA及其D1受体在CSD导致认知功能障碍中发挥的作用。本研究将为阐明SD导致的工作效率低下、事故隐患频发的神经机制研究提供新的实验资料,并为开发更具针对性的提神警醒药物提供新的思路。第一部分慢性睡眠剥夺对大鼠一般状态及学习记忆能力影响目的：建立慢性睡眠剥夺模型,探讨CSD对大鼠生理状态及学习记忆能力的影响。方-法：选用成年健康雄性Sprague Dawle大鼠110只,经过Morris水迷宫和负重游泳筛选出90只大鼠并随机分为3组：空白对照组(BC组n=30)、大平台对照组(TC组n=30)及慢性睡眠剥夺组(CSD组n=30)。采用改良多平台水环境睡眠剥夺法(MMPM)进行REM期睡眠剥夺,每天剥夺18h,连续21d。观察CSD后大鼠体重、皮毛、体力、精神状态及反应能力等生理指标变化。利用Morris水迷宫和自主活动箱检测大鼠空间学习记忆能力及自发活动能力。结果：与BC组和TC组相比,CSD组大鼠毛色无光泽、精神萎靡且易激惹。体重在各时间点较其他两组明显降低(P均小于0.01)。负重游泳力竭时间较其他两组明显缩短(P均小于0.01)。Morris水迷宫逃逸潜伏期与其他两组相比明显延长(P均小于0.01)、穿环数明显减少(P均小于0.01)、穿越平台所在象限时间百分比明显减少(P均小于0.05)；自主活动总路程较其他两组明显减少(P均小于0.05)、活动次数较其他两组也明显减少(P均小于0.01)。而TC组与BC组相比,以上各指标差异均没有统计学意义(P均大于0.05)。结论：慢性睡眠剥夺造成大鼠一般状况的改变,损害了大鼠的学习记忆能力及自发活动能力。第二部分慢性睡眠剥夺对大鼠前额皮质细胞凋亡及超微结构的影响目的：从形态学的角度阐明CSD后PFC组织结构的改变,探讨CSD导致学习记忆功能障碍的可能机制。方法：CSD21d结束后,随机选取各组大鼠6只,麻醉后用4℃生理盐水迅速经心灌流,再用4℃4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液灌流固定,切取含PFC的脑块放入4℃上述固定液中固定24h,石蜡切片后,采用TUNEL法检测PFC细胞凋亡情况；再随机选取各组大鼠4只,麻醉后先用4℃生理盐水灌注,再用4℃4%多聚甲醛-2.5%戊二醛-磷酸盐混合溶液灌流固定。固定后取全脑浸泡于4℃4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液中后固定24h。在体视显微镜下将含PFC的皮层部分切成1×1×1mm3的组织块,送第二军医大学电镜室进行包埋、超薄切片、铀-铅双染,透射电镜观察。结果：TUNEL结果显示,与BC、TC组相比,CSD组PFC中TUNEL染色阳性细胞数明显增多(P均小于0.01)。电镜结果显示,与BC、TC组相比,CSD组PFC神经元线粒体减少,线粒体嵴结构模糊甚至断裂；部分突触水肿,突触小泡减少,突触后致密带变薄或消失；粗面内质网结构模糊,其上的核糖体明显减少或消失。TC组与BC组相比,PFC的TUNEL染色阳性细胞数差异无统计学意义(P>0.05)；超微结构也没有明显变化。结论：CSD可造成大鼠PFC细胞凋亡增多,并引起超微结构改变。神经元细胞组织形态的改变可能影响PFC正常生理功能的发挥,进而导致学习记忆障碍。第三部分慢性睡眠剥夺对大鼠前额皮质多巴胺含量及D1受体表达水平的影响目的：探讨PFC中DA及其D1受体在CSD过程中的变化情况,探明CSD导致学习记忆功能损害的可能机制。方法：CSD21d结束后,每组随机选取大鼠14只,麻醉后用4℃生理盐水经心灌流,在冰上分离出PFC,其中8只大鼠的PFC利用高效液相电化学方法检测DA含量,其余6只大鼠的PFC利用Western blot检测D1受体蛋白的表达水平。另取各组大鼠6只,麻醉后用4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液经心灌流固定,取包含PFC的脑块于上述缓冲液中后固定24h,石蜡冠状切片后,采用免疫组织化学方法检测PFC中D1受体分布及表达水平。结果：与BC、TC组相比,CSD组大鼠PFC中DA含量明显减少(P均小于0.01)；D1受体蛋白表达水平明显降低(P均小于0.05)；各组大鼠PFC中D1受体染色阳性细胞散在分布,以神经元上表达为主。CSD组与其他两组相比,D1受体阳性细胞面积比明显降低(P均小于0.01)。但TC组与BC组相比,上述指标差异均无统计学意义(P均大于0.05)。结论：CSD后大鼠PFC中DA含量降低,D1受体蛋白表达水平下降,同时PFC中D1受体阳性表达数量也明显下降。表明CSD可能导致DA及其D1受体对神经元兴奋性调节功能下降。这种调控功能低下可能在CSD导致学习记忆功能障碍中发挥了重要作用。第四部分激活D1受体对慢性睡眠剥夺大鼠学习记忆能力的改善作用及其机制初探目的：通过研究D1受体激动剂SKF38393对CSD大鼠学习记忆能力、PFC神经元结构、DA含量及D1受体表达水平的影响,探讨PFC内D1受体在改善CSD导致的学习记忆能力障碍中的作用。方法：选用成年健康雄性Sprague Dawle大鼠110只,经过Morris水迷宫和负重游泳筛选出90只大鼠,随机分为3组：大平台组(TC+PBS组,n=30)、慢性睡眠剥夺组(CSD+PBS组,n=30)及激动剂组(CSD+drug组,n=30)。按第一部分方法,进行21d CSD。从CSD第15d开始,TC+PBS组和CSD+PBS组每天腹腔注射1ml PBS：CSD+drug组每天腹腔注射SKF38393药液(1mg/kg),连续给药7d。观察各组大鼠一般情况、学习记忆能力及自发活动能力的变化；PFC神经元细胞凋亡程度、超微结构的变化；PFC中DA含量、D1受体表达的变化。结果：给药后与CSD+PBS组相比,CSD+drug组毛色、体重、负重游泳力竭时间均无明显差异(P均大于0.05),但与TC+PBS组相比,体重在各时间点仍呈下降趋势(P均小于0.01),负重游泳力竭时间仍明显减少(P<0.01)。Morris水迷宫结果显示：在CSD第7、14d时,CSD+drug组与CSD+PBS组相比,逃逸潜伏期、穿环数及穿越平台所在象限时间百分比的差异无统计学意义(P均大于0.05)；药物干预7d后,即在CSD第21d时,CSD+drug组与CSD+PBS组相比,逃逸潜伏期缩短、穿环数及穿越平台所在象限时间百分比增多(P均小于0.05)；但与TC+PBS组相比,在各时间点逃逸潜伏期均明显延长,穿环数及穿越平台所在象限时间百分比均明显减少(P均小于0.01)。自主活动能力检测结果显示：药物干预7d后,与CSD+PBS组相比,CSD+drug组自主活动总路程、活动次数明显增多(P均小于0.05)；但与TC+PBS组相比,自主活动总路程、活动次数仍明显减少(P均小于0.05)。TUNEL染色结果显示,与CSD+PBS组相比,CSD+drug组PFC中阳性细胞数明显减少(P<0.01)；但与TC+PBS组相比,阳性细胞数仍较多(P<0.01)。电镜结果显示,与CSD+PBS组相比,CSD+drug组PFC神经元中线粒体较多,线粒体嵴结构较清晰,突触小泡较多,突触后致密带较厚；粗面内质网结构较清晰,其上的核糖体明显增多；但与TC+PBS组相比,CSD+drug组上述各指标仍较差。高效液相电化学结果显示,与CSD+PBS组相比,CSD+drug组PFC中DA含量明显升高(P<0.01)；但与TC+PBS组相比,DA含量仍明显减少(P<0.01)。Western blot(?)果显示,与CSD+PBS组相比,CSD+drug组PFC中D1受体蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；但与TC+PBS组相比,D1受体蛋白表达水平仍较低(P<0.01)。免疫组织化学结果显示,与CSD+PBS组相比,CSD+drug组PFC中D1受体阳性细胞面积比明显升高(P<0.01)；但与TC+PBS组相比,D1受体阳性细胞面积比仍明显降低(P<0.01)。结论：应用D1受体激动剂SKF38393后,CSD大鼠一般状态得到改善,学习记忆能力得到部分恢复。伴随功能恢复的同时,大鼠PFC中DA含量及D1受体表达明显提高,PFC神经元细胞凋亡数目减少,超微结构得到改善。表明DA可能通过PFC内D1受体,在改善CSD导致的学习记忆功能障碍中发挥着重要作用。