肝片吸虫病是十分常见的人畜共患寄生虫病,普遍存在于牛、羊等反刍动物。在我国各省区呈区域性流行,一年四季均可发生,特别是夏秋季节非常普遍。牛、羊的感染率最高,羊的感染率可达30%～50%,甚至部分地区全部感染,牛的感染率有30%～60%,部分地区90%以上。肝片吸虫病会致使动物发育停滞,体重消减,耕牛生产力低下,乳牛产奶量减少,毛和肉产量减少并且品质降低,给畜牧业造成巨大的经济亏损。硝碘酚腈(Nitroxynil)是20世纪60年代末研制的高效抗肝片吸虫药,对肝片吸虫和大片吸虫的成虫期均都具有很高的疗效,然而药物与血浆蛋白具有高度结合力(结合率>97%),使游离硝碘酚腈在组织内集聚量很少,以致在推荐剂量下,肝实质中的药物浓度不足以杀灭未成熟的幼虫。在临床中肌内注射与皮下注射为首选方式,然而在给药部位发生炎性肿胀,动物出现摇头、走路摇晃、呼吸急促甚至死亡等现象。脂质体作为药物的载体系统,将药物包封于脂质双分子层中,可以提高药物在机体内的靶向性,增强治疗效果,降低毒副作用,已经在医学临床中得到广泛的应用。脂质体双分子层生物膜主要由磷脂和胆固醇组成,未经修饰的脂质体经静脉给药进入动物机体中,被巨噬细胞作为“侵入者”吞噬而产生天然靶向性,主要由肝和脾中的吞噬细胞(网状内皮细胞)吞噬,因此脂质体是用于治疗肝寄生虫病、利什曼原虫病等肝脏内寄生虫病的理想药物载体。本试验使用脂质体包封技术制备硝碘酚腈脂质体,旨在提高其有效生物利用度、延长作用时间、降低药物毒性作用,并探究其临床使用意义。1硝碘酚腈脂质体的制备方法：采用薄膜超声法制备硝碘酚腈脂质体,以磷脂-胆固醇质量比(A)、药脂比(B)、超声时间(C)、水化温度(D)四个因素进行正交试验设计L9(34),以包封率为指标,筛选最佳工艺。结果：经试验数据分析,各因素对工艺的影响程度：B>A>D>C.最佳工艺处方为：磷脂-胆固醇质量比为2：1,药脂比为3：1,超声时间6min,水化温度40℃。经重复性验证该处方包封率为50.05±1.62%。结论：本试验筛选出的处方及工艺所制备的硝碘酚腈脂质体包封率较好、重现性好。2硝碘酚腈脂质体的质量评价2.1HPLC测定脂质体中硝碘酚腈含量方法的建立方法：色谱条件：流动相：乙腈-0.01 mol/L磷酸盐pH6.5(25:75, V/V);色谱柱：Phenomenex-C18 (4.6 mm x 250 mm,5μm);流速：1.5 mL/min;柱温：40℃；检测波长：271 nm；进样量：10μL。结果：经方法学验证,该色谱条件适合硝碘酚腈含量测定,出峰时间合适,峰形对称,与其他杂质峰分离度良好,重现性与精密度均符合要求。标准曲线为y=25250x-173662,R2=0.9999,线性范围：10-400μg/mL。2.2粒径的测定方法：使用Zetasizer Nano分析仪动态光散射法测定脂质体粒径大小。结果：硝碘酚腈脂质体粒径于200-300nnm呈正态分布。2.3包封率测定方法：以葡聚糖凝胶柱内径与填充高度比(A),加样量(B),流速(C)三个因素设计正交试验,筛选葡聚糖凝胶柱分离硝碘酚腈脂质体的最佳条件,收集脂质体流出液,使用HPLC测定硝碘酚腈含量,计算包封率。结果：使用100-300μm的葡聚糖凝胶G-50作为层析基质,葡聚糖凝胶柱内径与填充高度比：2：7,加样量：1.0mL,流速：1mL-min-1。洗脱曲线显示,脂质体洗脱时间为4-15min。收集流出液用10%Trixton-100溶液破乳,用HPLC测定硝碘酚腈含量。结论：本试验方法制得脂质体粒径分布较均匀,使用葡聚糖凝胶柱分离硝碘酚腈脂质体出峰时间合适,可以有效分离硝碘酚腈脂质体与游离硝碘酚腈。3硝碘酚腈脂质体在家兔体内药动学试验方法：选择健康家兔2组,比较耳缘静脉注射相同剂量(8.8mg/kg)的硝碘酚腈注射液与硝碘酚腈脂质体,分别于Smin, 10min,15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、4h、 8h、12h、24h、36h采血,使用上述HPLC方法测定含量,用3P97软件分析药动学模型以及药动学参数。结果：HPLC绘制血液中硝碘酚腈标准曲线为：y=27547x-31146,R2=0.9995。线性范围均为6.25-400μg/mL。硝碘酚腈注射液和硝碘酚腈脂质体耳缘静脉注射后的血药浓度-时f间分布均符合—级吸收二室模型。硝碘酚腈注射液在家兔体内主要动力学参数为：A=14.44±1.25μg/mL, a=3.10±0.37/h, B=15.50±2.88μg/mL, β=0.031±0.0028/h, V (c)=0.29±0.00083 L), Tl/2a= 0.22±0.0028h; Tl/2β=22.21±2.48h, AUC=501.18±35.76 CL(s)=0.018±0.0007 mg/kg/h/(μg/mL)。硝碘酚腈脂质体在家兔体内主要动力学参数：A=8.85±0.71μg/mL, a=1.80±0.25/h, B=13.08±1.22μg/mL, β=0.0155±0.002/h, V (c)=0.4±0.025 (mg/kg)/(pg/mL), Tl/2α= 0.38±0.011h, T1/2β= 44.83±0.29h, AUC=851.30±48.37(μg/mL)*h, CL(s)=0.0103±0.0009 mg/kg/h/(μg/mL)。硝碘酚腈脂质体消除半衰期延长(T1/2β)、中央室分布容积(Vc)增大,与硝碘酚腈注射液比较有极显著差异(p<0.01)。结论：硝碘酚腈脂质体在家兔体内消除半衰期显著延长、中央室分布容积增大,生物利用度升高,揭示其具有缓释作用。4硝碘酚腈脂质体的肝脏靶向性初步研究选择健康KM小鼠2组,尾静脉注射相同剂量的硝碘酚腈注射液与硝碘酚腈脂质体,分别于15min.30min、45min、1h、2h、4h、8h、12h、24h解剖小鼠,采集肝脏组织,使用上述HPLC分析方法进行含量测定。结果HPLC绘制肝脏组织标准曲线为：y=26156x+36621,R2=0.9996。线性范围为6.25～400μg/mL。硝碘酚腈注射液与硝碘酚腈脂质体肝脏中AUC注=87.00(μg/mL)*h, AUC脂=197.29(μg/mL*h,肝脏相对摄取率re=2.27。结论：硝碘酚腈脂质体中肝脏re=2.27,AUC 注与AUC脂差异极显著,表明具有良好的靶向性。总结：本课题筛选的硝碘酚腈脂质体制备工艺合理,所制备出的脂质体具有较好的药动学特征及肝脏靶向性,揭示其可能有效的改善硝碘酚腈的副作用与生物利用度。