论文部分内容阅读
本研究分为3部分：1.let-7a在脑缺血再灌注后的表达及其作用在本部分研究中，我们通过对正常大鼠、缺血再灌注大鼠脑内let-7a的表达的检测，发现let-7a在脑缺血再灌注后，在脑组织内高表达。为进一步研究let-7a在体内的作用，我们构建过表达let-7a的AAV9质粒，通过尾静脉注射的方式使之在大鼠体内过表达。与普通大鼠相比，过表达let-7a的大鼠在缺血再灌注后脑组织病理改变严重、神经功能缺损评分增高，并且脑组织的内炎症因子IL-6和TNF-α含量高于普通大鼠，细胞凋亡程度也明显重于普通大鼠。此结果提示let-7a在脑缺血再灌注后表达上调，并促进缺血再灌注后的炎症反应和细胞凋亡，进而加重神经损伤。2.MKP1在脑缺血再灌注后的表达及其作用MKP1是一种重要的抗炎、抗凋亡蛋白，通过数据库比对可以发现MKP1可能是let-7a的下游作用靶点。在本部分研究中，我们对MKP1在脑缺血再灌注后的作用进行研究。将大鼠分为假手术（Sham）组、对照组（Control）、MKP1抑制剂组（MKP1抑制剂-Sanguinarine chloride，血根碱）。其中，Sham组不做任何处理，Control组大鼠经尾静脉注射生理盐水，抑制组经大鼠尾静脉注射MKP1抑制剂，Sham组大鼠在脑缺血再灌注模型制备时线栓未阻断血流。与对照组大鼠相比，MKP1抑制剂组的大鼠在缺血再灌注后出现脑组织病理改变严重、梗死面积大、神经功能缺损评分高。同时，MKP1抑制剂组大鼠脑组织的炎症因子TNF-α和IL-6含量高于对照组大鼠，Tunel和染色阳性细胞数以及小胶质细胞增生也明显多于对照组大鼠。结果提示MKP1有抑制炎症反应、细胞凋亡、神经保护的作用。3.let-7a对MKP1的调节在本部分研究中，我们对let-7a与MKP1两者之间的具体作用进行研究。通过western blot实验结果证实，let-7a mimic可下调神经元细胞系PC12细胞中MKP1蛋白的表达，而let-7a抑制剂let-7a inhibitor可促进其蛋白表达，但两者均不影响MKP1mRNA的水平。Luciferase assay显示，转染let-7a mimic后，含野生型MKP1的3’-UTR段的荧光报告质粒的荧光表达强度明显降低，将MKP13’-UTR突变后，let-7a不能降低荧光报告质粒的荧光表达强度。此结果表明，let-7a可通过结合MKP13’-UTR端在转录后水平下调MKP1的表达。本研究还发现，let-7a可上调缺氧状态下PC12细胞的凋亡，过表达MKP1的PC12细胞可抑制let-7a促PC12细胞凋亡的作用。进一步研究说明，let-7a可直接靶向作用于重要抗炎、抗凋亡因子MKP1，通过对MAPK信号通路的调控从而加促进神经细胞损伤。