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肿瘤多药耐药(multidrug resistance, MDR)是肿瘤治疗中面临的一大难题。肿瘤对化疗药物产生耐药性的机制十分复杂,主要包括：药物外排泵ABC转运蛋白(P-glycoprotein, Pgp等)过量表达,药物作用靶点的改变,DNA损伤修复活性增强,药物解毒、消除酶活性增强或过量表达及肿瘤细胞凋亡敏感性的降低等。本文探讨了两种汉防己甲素衍生物抑制P-glycoprotein逆转MDR及5-溴代汉防己甲素增强内在耐药的肝癌细胞Bel7402对阿霉素诱导凋亡的敏感性的作用机理。采用MTT方法检测两种汉防己甲素衍生物的细胞毒性,W6和W18发现对耐药的肿瘤细胞及其对应的亲本细胞(KBv200和KB细胞、MCF-7/Dox和MCF-7细胞、A549/Taxol和A549细胞)的细胞毒作用无显著性差异,提示W6和W18不是药物外排泵ABC转运蛋白(P-glycoprotein, Pgp等)的底物。Western blot检测与MDR关系最为密切的三种药物外排泵Pgp、MRP 1和BCRP在上述六种细胞和内在耐药的Bel7402细胞中的表达水平,发现Pgp在获得性耐药KBv200和MCF-7/Dox细胞中表达水平显著升高,在获得性耐药的A549/Taxol细胞中略有升高；MRP1蛋白在获得性耐药的A549/Taxl细胞及其对应的亲本细胞A549中表达水平显著升高,在获得性耐药的KBv200和MCF-7/Dox细胞中略有升高；BCRP蛋白在上述7种细胞中的表达水平都较低,在MCF-7/Dox和A549细胞中的表达水平高于其他细胞。无毒浓度的W6或W18 (0.25μM、0.5μM、1.OμM)能剂量依赖性的提高获得性耐药肿瘤细胞KBv200和MCF-7/Dox对Pgp底物长春新碱、阿霉素和紫杉醇的敏感性,1.0gM浓度下几乎完全逆转KBv200和MCF-7/Dox对上述三种抗肿瘤药物的耐药性,逆转活性强于10gM的Pgp底物竞争性抑制剂维拉帕米,W6或W18(0.25μM、0.5μM、1.OμM)也能提高获得性耐药的A549/Taxol对上述三种Pgp底物的敏感性,但逆转活性较低；W6或W18在1.0gM浓度下对过量表达MRP1蛋白的A549细胞对MRP1底物长春新碱和阿霉素的敏感性没有影响,提示W6和W18的MDR逆转活性与Ppg的过量表达水平关系密切,与MRP1蛋白和BCRP蛋白的过表达水平不相关,两种化合物W6和W18很可能通过抑制Pgp逆转多种耐药肿瘤细胞的耐药性。内在耐药的Bel7402细胞Pgp、MRP1和BCRP的表达水平都很低,但W6或W18 (0.25μM、0.5μM、1.0μM)仍能剂量依赖性的提高其对上述三种抗肿瘤药物的敏感性,提示Bel7402细胞内在耐药的作用机制很可能与Pgp、MRP1和BCRP的过表达无关,两种化合物W6和W18通过其它作用机制逆转Bel7402细胞MDR表型。采用阿霉素蓄积实验检测W6和W18对Pgp功能的影响,W6或W18(0.25μM、0.5μM、1.0μM)能剂量依赖性的增加阿霉素在Pgp过表达的KBv200和MCF-7/Dox细胞中浓度,抑制Pgp对阿霉素的外排作用。采用化学发光方法进一步检测W6和W18抑制Pgp功能的作用机制,W6 (12.5μM,25μM,50μM)能剂量依赖性的抑制基础水平的Pgp ATPase活性,也能抑制Pgp底物维拉帕米(200μM)刺激引起的升高的Pgp ATPase活性；W18 (12.5μM,25μM,50μM)对生理水平的Pgp ATPase活性没有影响,但是能抑制Pgp底物维拉帕米(200μM)刺激引起的升高的PgP ATPase活性,提示W6和W18不是Pgp的竞争性转运底物,而是通过抑制Pgp结合或水解ATP进而抑制其转运功能。Western blot检测两种汉防己甲素衍生物W6和W18对Pgp表达的影响,W6或W18(1.0gM)能时间依赖性的降低KBv200细胞Pgp的表达水平。RT-PCR检测W6和W18对mdr1基因转录水平的影响,W6或W18(1.0μM)对KBv200细胞Pgp的mRNA水平没有影响,对MRP1、BCRP和LRP的mRNA水平也没有影响,提示两种汉防己甲素衍生物W6和W18通过其他作用机制下调Pgp表达。鉴于肿瘤细胞凋亡敏感性降低在MDR中的作用,采用Western blot检测两种汉防己甲素衍生物W6和W18对凋亡存活通路中关键蛋白的影响,与敏感的KB细胞相比,耐药的KBv200细胞中PI3K/Akt存活通路活性显著降低,MAPK/Erk1/2存活通路活性显著升高,促凋亡蛋白p53表达水平略有降低,促凋亡蛋白Bax表达水平显著降低,抗凋亡蛋白XIAP表达显著升高,Bcl-2水平没有变化,W6或W18(1.0μM)能抑制Erk1／2存活通路活性,但随着时间的推移,抑制作用有所减弱；对PI3K/Akt存活通路、p53、Bax、XIAP和Bcl-2均没有影响。本研究还讨论了5-溴代汉防己甲素增强内在耐药肝癌细胞Bel7402对阿霉素诱导的凋亡的敏感性的作用机理。早期研究发现5-溴代汉防己甲素(BrTet)通过影响PgP的表达和功能在体外、体内有很强的肿瘤多药耐药(MDR)逆转作用。在对BrTet逆转MDR作用机制的进一步研究过程中发现BrTet能增强耐药肿瘤细胞Bel7402凋亡的敏感性,乃对BrTet增强凋亡敏感性的机制做进一步探讨。Bel7402细胞与不同浓度BrTet和阿霉素(Dox) (3μM)共培养,或者与Dox (3μM)或BrTet单独培养24h,以维拉帕米(Vrp) (10μM)作为阳性对照。采用Hochest33258染色法观察细胞形态学变化,PI染色流式细胞技术分析细胞周期和凋亡百分率,琼脂糖凝胶电泳分析细胞DNA片段化状态,caspase-3荧光底物Ac-DEVD-pNA检测caspase-3活性,Western blot检测凋亡相关蛋白Fas、FasL、caspase-8、caspase-3、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2的表达变化及线粒体膜间隙蛋白细胞色素C和AIF的释放,JC-1染色检测线粒体膜电位变化情况。Dox (3μM), BrTet (4μM)或Vrp (10μM)单独作用Bel7402细胞24 h,细胞均未发生凋亡。当BrTet (lμM,2μM,4μM)、Vrp (10μM)培养细胞24 h,去除药物,再加入DOX (3μM)继续培养24 h, Bel7402细胞出现明显凋亡,且凋亡百分率与BrTet的浓度呈剂量依赖性关系。相同的给药方案,BrTet (4μM),Vrp (10能明显增强DOX (3μM)诱导的caspase-3的活化,促使线粒体细胞色素C和AIF的释放,降低线粒体膜电位,提高Bax与Bcl-2相对比例；但对Fas、FasL和caspase-8的表达无影响。提示BrTet能增强Bel7402细胞对Dox诱导凋亡的敏感性,其机制可能是提高Bax与Bcl-2蛋白的比例,降低线粒体膜电位,进而影响线粒体的功能,激活细胞内源性凋亡通路,诱导凋亡综上所述,本研究中两种汉防己甲素衍生物W6和W18在体外能逆转多种耐药肿瘤细胞的MDR表型,作用机理是抑制P-glycoprotein的药物外排功能和过量表达,抑制MAPK/Erk1/2通路活性,它们的其它作用机制和体内活性值得进一步深入研究。此外,本研究中BrTet能增强Bel7402细胞对Dox诱导凋亡的敏感性,其机制可能是提高Bax与Bcl-2蛋白的比例,降低线粒体膜电位,进而影响线粒体的功能,激活细胞内源性凋亡通路。BrTet已完成Ⅰ期临床试验,正拟申请Ⅱ期临床试验,这为BrTet的临床研究提供了新的实验依据。