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研究背景癫痫是严重危害人类健康的慢性脑部疾病之一,我国目前约有900万癫痫患者,给社会、家庭和个人都带来了沉重负担。约有20%～30%的癫痫患者用现有的抗癫痫治疗方法不能很好地控制发作,演变为难治性癫痫,颞叶癫痫是其中最常见的一种类型。近年来,对颞叶癫痫的病因、病理及治疗等研究已经取得了很大进展,但它的发病机制仍未完全阐明。颞叶癫痫一个重要的病理变化是海马硬化,表现为神经元脱失和胶质细胞增生。癫痫发作能造成神经元损伤已被广泛认可,一般认为癫痫发作可诱导谷氨酸过度释放,激活谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-asparate,NMDA)受体,触发钙离子向神经元内流,激活一氧化氮合酶,产生大量自由基,活化多种与细胞死亡相关的蛋白,最终造成神经元发生程序性死亡。目前,癫痫发作致神经元损伤的死亡形式及分子机制仍不十分清楚,对癫痫发作后的神经元保护也缺乏有效手段。聚腺苷二磷酸核糖多聚酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]是一种存在于真核细胞中的非组蛋白染色体蛋白质,具有蛋白修饰和核苷酸聚合作用,参与DNA的复制、转录、修复、基因调控、信号传导及细胞死亡等过程。在生理状态下,PARP催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成大分子聚腺苷二磷酸核糖聚合物,激活DNA修复系统发挥基因修复作用。当DNA受损过重时,PARP被过度活化,会耗竭细胞内能量、激活细胞死亡相关蛋白、引起炎症反应。研究证实,PARP与肿瘤、炎症、自身免疫性疾病多种疾病密切相关。在中枢神经系统中,PARP-1基因敲除或药物抑制在脑缺血再灌注、兴奋性毒性、脑创伤等病理生理状态中也表现出了明显的神经保护作用。最近的研究还提示,PARP参与调节神经元死亡很可能与凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)信号,蛋白激酶B(proteinkinase B,Akt)依赖的细胞生存信号,核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)相关的的炎症信号等有关。到目前为止,PARP是否参与癫痫诱发的神经元程序性死亡,PARP抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3-aminobenzamide,3-AB)是否对癫痫致海马损伤具有保护作用仍未见报道。本研究建立红藻氨酸(kainic acid,KA)诱导的大鼠颞叶癫痫模型,探讨癫痫发作后海马神经元损伤后的病理特征;应用PARP抑制剂3-AB进行干预,检测与细胞死亡相关的蛋白和信号分子,探讨PARP在大鼠癫痫致海马损伤中的作用及其分子机制。本研究分三部分第一部分聚腺苷二磷酸核糖多聚酶在癫痫大鼠海马损伤中作用的研究目的探讨KA诱导大鼠癫痫模型海马神经元损伤的病理特征;研究PARP在致痫大鼠海马组织的变化规律及PARP抑制剂3-AB对癫痫致海马神经元损伤的保护效果方法1.应用立体定向脑室内微量注射的方法建立KA诱导的大鼠颞叶癫痫模型。实验动物在检测PARP活性时分为对照组、KA致痫2 h、6 h、12 h、24 h、72 h组;在检测3-AB对PARP抑制作用及对海马神经元保护作用时分为对照组、KA致痫组、KA+生理盐水组及3-AB干预组(KA+3-AB组)2.应用HE染色和Nissl染色观察各实验组大鼠癫痫后海马神经元的形态及数目改变3.应用电镜观察各组大鼠癫痫后海马神经元的形态特征4.应用免疫组织化学和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PARP活性指标聚腺苷二磷酸核糖(PAR)在癫痫发作后不同时程的变化5.应用Western blot检测3-AB对癫痫发作后PARP活性变化的作用结果1.正常大鼠海马CA1、CA3区锥体细胞结构清晰完整,细胞核结构正常,染色质分布均匀,胞浆内尼氏小体丰富。癫痫发作后大鼠海马神经元肿胀、排列紊乱,膜破裂,胞浆尼氏小体减少。3-AB干预组大鼠海马锥体细胞边缘清晰,形态正常,仅少量神经元染色质凝聚、轮廓模糊。电镜下,受损神经元表现为胞核内染色质凝聚、边集,线粒体嵴消失、肿胀,细胞器减少,胞浆内形成大小不等的空腔和空泡,细胞膜破裂,细胞内容物泄漏等2.大鼠海马CA1、CA3区锥体细胞数目在癫痫发作72 h(47.22±4.95;53.26±8.08)后较对照组(85.23±6.71;131.91±14.24)明显减少(P＜0.05);3-AB干预组大鼠海马存活神经元数目(62.37±6.57;106.28±9.52)较KA+生理盐水组(50.07±5.91;54.31±8.02)显著增加(P＜0.05)3.PAR免疫组化研究显示,对照组大鼠海马神经元细胞核PAR棕黄色染色很弱,KA致痫、KA+生理盐水组大鼠海马锥体细胞胞核呈棕黄色深染,3-AB干预组大鼠海马神经元为浅或中等程度棕黄色颗粒沉积。Western blot研究发现,大鼠致痫后2h海马组织PAR表达升高(P＜0.05),在6h达高峰(P＜0.05),并持续增高12 h(P＜0.05),在24 h后逐渐恢复至对照组水平4.Western blot研究显示,3-AB干预组较KA+生理盐水组大鼠海马PAR的表达显著降低(P＜0.05)结论1.KA致痫大鼠海马神经元受损明显、数目减少,受损神经元表现为坏死样形态2.PARP活性在癫痫发作后表现出时间依赖性增高,该变化可被3-AB抑制3.3-AB可减轻癫痫发作造成的海马神经元损伤第二部分PARP调节癫痫大鼠海马凋亡诱导因子及蛋白激酶B表达的研究目的探讨KA致痫大鼠海马组织AIF及Akt、糖原合酶激酶-3β(glycogen synthase-3β,GSK-3β)随时间的变化规律及PARP对抑制剂3-AB对其的调节作用方法1.检测AIF、Akt及GSK-3β在致痫后大鼠海马表达规律时分为对照组、KA致痫2 h、6 h、12 h、24 h、72 h组;检测3-AB对AIF的作用时分为对照组、KA致痫组、KA+生理盐水组及KA+3-AB组;检测3-AB对Akt及GSK-36的作用时分为对照组、KA致痫组、KA+生理盐水组、KA+3-AB组、KA+生理盐水+二甲基亚砜组与KA+3-AB+LY294002组2.应用Western blot检测各组大鼠海马组织AIF、Akt及GSK-3β的表达结果1.大鼠致痫后12 h海马线粒体中AIF表达减少(P＜0.05),24 h后降至最低(P＜0.05),72 h后仍低于对照组水平(P＜0.05);与之对应,海马组织核蛋白内AIF的含量在大鼠致痫后6 h增高(P＜0.05),24 h达顶峰(P＜0.05),72 h后其含量水平仍高于对照组(P＜0.05)2.应用3-AB干预后,AIF在癫痫大鼠海马组织线粒体的含量明显高于KA+盐水组大鼠(P＜0.05),与之对应,AIF在细胞核的表达水平较实验对照组显著降低(P＜0.05)3.大鼠海马组织磷酸化Akt水平在致痫后2 h出现增高(P＜0.05),6 h后恢复至对照组水平;磷酸化GSK-3β在致痫后6 h降低(P＜0.05),持续维持低水平至痫后24 h(P＜0.05),在致痫后72 h恢复到对照组水平4.应用3-AB后,磷酸化Akt及GSK-3β蛋白水平在痫后大鼠海马组织表达显著增高(P＜0.05);应用LY294002干预后,磷酸化Akt及GSK-3β表达水平较KA+3-AB组明显降低(P＜0.05)结论1.癫痫发作可诱发海马组织AIF由线粒体向细胞核的转位,3-AB能明显抑制癫痫诱发的AIF核转位2.癫痫发作可引起海马组织Akt及GSK-3β表达改变,3-AB能明显提高Akt及GSK-3β的磷酸化水平,该变化可被LY294002抑制第三部分PARP调节癫痫大鼠海马核转录因子κB活性及炎症因子表达的研究目的探讨PARP抑制剂3-AB对KA致痫大鼠海马组织NF-κB及白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的作用方法1.检测NF-κB p65在致痫后海马不同时程的表达规律时分为对照组、KA致痫2 h、6 h、12 h、24 h、72 h组;检测3-AB对NF-κB及炎症因子的作用时分为对照组、KA致痫组、KA+生理盐水组及KA+3-AB组2.应用Western blot检测各组大鼠海马组织NF-κB p65的表达3.采用逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot分别检测各组大鼠海马IL-1β、COX-2和MMP-9 mRNA和蛋白的变化结果1.NF-κB p65在大鼠致痫后2 h海马组织核蛋白中含量增高(P＜0.05),6 h后达高峰(P＜0.05),并持续增高至痫后12 h(P＜0.05),在24 h后恢复至对照组水平2.3-AB干预组较KA+生理盐水组大鼠海马NF-κB p65在细胞核的表达明显降低(P＜0.05)3.KA致痫6 h组大鼠海马IL-1β、COX-2和MMP-9 mRNA和蛋白表达较对照组都明显增加(P＜0.05),应用3-AB后,IL-1β、COX-2和MMP-9的mRNA和蛋白表达较同时间点KA+生理盐水组明显降低(P＜0.05)结论1.癫痫发作可激活海马组织NF-κB,NF-κB p65的核转位可被3-AB抑制2.癫痫发作可引起海马组织IL-1β、COX-2和MMP-9的表达增高,3-AB能明显减少上述炎症因子的表达研究意义本研究应用大鼠颞叶癫痫模型,首次在成体动物水平证实PARP参与癫痫发作致海马神经元损伤过程,并进一步证实了PARP抑制剂3-AB可以通过调节凋亡诱导因子介导的细胞死亡信号、蛋白激酶B依赖的细胞生存信号及核因子κB调节的炎症信号等发挥神经保护作用。尽管研究中未发现3-AB可以直接减轻癫痫大鼠痫性放电的程度,但本研究的结果仍有助于阐明癫痫致海马神经元损伤及癫痫致学习、记忆能力损害的机制,也有助于寻找新的药物作用靶点,研发新的神经保护或记忆改善药物