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背景:骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell,MSC)移植治疗心肌梗死(MyocardialInfarction,MI)极有发展前景,但临床试验结果显示治疗效果微弱,移植细胞在缺血心肌极低的滞留率和存活率是主要原因之一。对MSC进行基因修饰或使用生物材料来承载后移植可改善这一问题。Bcl-2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)基因能抑制细胞凋亡。VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)基因能促血管生成。可注射水凝胶(Injectable Hydrogel,IH)具有可注射性、生物降解性和组织细胞相容性,能承载细胞进行移植。目的:使用IH联合Bcl-2和VEGF双基因修饰拟提高MSC移植对MI的疗效,为临床使用提供实验基础及理论依据。方法和结果:1、PCR扩增获取Bcl-2和VEGF基因并使用T2A序列连接以实现双基因的共表达。构建能同时携带Bcl-2和VEGF基因的慢病毒载体并筛选构建能稳定过表达Bcl-2和VEGF基因的SD大鼠MSC。荧光定量PCR和Western blot结果证实Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC对比Bcl-2或VEGF单基因表达MSC对Bcl-2和VEGF基因有更高的表达。CCK-8结果说明Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC对比Bcl-2或VEGF单基因表达MSC增殖更快。2、体外糖氧剥夺(Oxygen and Glucose Deprivation,OGD)模型模拟体内缺血缺氧微环境,实验分为五组:MSC-GFP组、MSC-VEGF组、MSC-Bcl-2组、MSC-BV 组、MSC-GFP 正常培养组。AnnexinV-FITC/PI 流式细胞术和 Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3,结果表明OGD诱发了MSC的凋亡,Bcl-2或VEGF单基因修饰的MSC凋亡减少,Bcl-2和VEGF双基因修饰的MSC-BV较Bcl-2或VEGF单基因修饰的MSC凋亡减少更显著。ELISA结果显示Bcl-2和VEGF双基因修饰能增强OGD环境下MSC旁分泌VEGF,bFGF,HGF 和 IGF-1。3、IH携带Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC进行对MI大鼠的移植治疗,实验分为六组:SHAM组、PBS组、IH组、MSC组、MSC+BV组、MSC+BV+IH组。细胞移植治疗4周后心脏超声结果提示MSC+BV+IH组的心脏收缩功能改善更显著。HE和Masson染色结果提示MSC+BV+IH组的梗死面积显著缩小。cTnT免疫荧光结果提示MSC+BV+IH组心肌存活更多。TUNEL和Western blot结果提示MSC+BV+IH组心肌细胞凋亡减少更显著。vWF和a-SMA免疫荧光结果提示MSC+BV+IH组血管密度更高。CM-Dil标记MSC移植提示MSC+BV+IH组的细胞滞留改善更明显。4、原代培养SD乳鼠心肌细胞,与MSC使用Transwell共培养系统置于1%02缺氧处理24h,实验分为四组:心肌细胞正常培养组、心肌细胞缺氧组、心肌细胞+MSC+GFP缺氧组、心肌细胞+MSC+BV缺氧组。采用Annexin V-FITC/PI流式细胞术、Western blot检测凋亡蛋白Cleaved-capase-3、TUNEL分析心肌细胞凋亡,结果表明与Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC共培养更能减少缺氧状态下心肌细胞的凋亡。结论:1、成功构建了 Bl-2和VEGF双基因共表达重组慢病毒载体;筛选构建了Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC;对比Bcl-2或VEGF单基因表达MSC,其对目的基因Bcl-2和VEGF有更高的表达,更快的增殖速度。2、Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC对比Bcl-2或VEGF单基因表达MSC在体外糖氧剥夺环境下发挥更好的自我保护和旁分泌作用。3、Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC移植对心肌梗死有更好的治疗作用,可注射水凝胶的承载移植进一步增强了 MSC的治疗作用。4、Bcl-2和VEGF双基因共表达MSC体外通过旁分泌作用保护缺氧心肌细胞。