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广藿香是一种经济价值很高的热带药用和香料作物,用途十分广泛。由于与原产地气候条件等方面的差异,在我国华南等地栽培很难开花结实,因而生产上一直采用扦插来繁殖种苗,结果导致病原体积累、种质退化、病虫危害严重,同时由于广藿香不能利用种子进行有性繁殖,也就不可能利用杂交育种等传统育种方法进行新品种选育。因此,利用组织培养技术进行优良种质的快速繁殖,通过转基因技术转入抗性基因,培育出优质、抗病力强、产量高的新品种具有十分重要的意义。本研究对海南广藿香组培快繁技术进行了系统和深入的研究,建立了高效的广藿香快速繁殖技术体系,能为广藿香的规范化种植提供优质种苗;同时,在此基础上建立了以叶片和茎段为外植体的不定芽和愈伤组织的高频再生体系;并对农杆菌介导的遗传转化的影响因素进行了初步研究,为下一步进行广藿香的遗传转化获得转基因植株奠定了基础。
以广藿香田间苗和试管苗的叶片和茎段为实验材料进行了不定芽再生体系和组培快繁的研究。实验结果表明:在使用植物生长调节剂诱导不定芽时,细胞分裂素类物质6-BA和KT对不定芽诱导有较强的促进作用;相同培养条件下,试管苗叶片的再生能力最强,在MS+6-BA0.5mg/L培养基上平均每个外植体能产生19.88个不定芽。选择3个浓度的6-BA、TDZ以及蔗糖进行正交试验Lg(33),正交试验筛选得到不定芽增殖培养的最佳培养基为MS+6-BA0.5mg/L+TDZ0.025mg/L+蔗糖4%,增殖倍数为66.0。芽增殖过程中芽苗基部易产生愈伤组织,添加1g/L的活性炭能有效抑制基部愈伤组织的形成。以MS和1/2MS为基本培养基,分别添加生长素NAA、IBA,进行试管苗生根试验,1/2MS+IBA0.1mg/L生根效果最好,高浓度的生长素对植株有一定毒害作用。试管苗的出瓶移栽以混合基质(泥炭土:珍珠岩:河砂=3:1:1)效果最好,移栽成活率可达100%。
以广藿香试管苗叶片和茎段为外植体进行广藿香愈伤组织再生体系的研究。实验通过单植物生长调节剂和植物生长调节剂组合试验筛选出诱导愈伤组织最佳培养基为6-BA0.5mg/L+2,4-D0.2mg/L,以叶片为外植体效果最好,得到的愈伤组织具有良好的增殖和分化能力。将叶片愈伤组织继代增殖培养,得到“S”型的愈伤组织生长曲线,愈伤组织的最佳继代周期为18d。诱导叶片愈伤组织出芽的最佳培养基配方是MS+6-BA0.5mg/L+TDZ0.05mg/L,培养10d时平均每块愈伤组织有8.55个芽,20d时达到24.33个,芽在10~20d内能迅速形成,继续提高植物生长调节剂浓度,愈伤组织及其分化出的不定芽发生玻璃化。由愈伤组织再生出的植株在移栽后未见明显的变异。
在建立了广藿香不定芽再生体系和愈伤组织再生体系的基础上,本论文分别以广藿香叶片和愈伤组织为转化受体,以携带双元质粒载体pCAMBIA1305.1(含35S启动子启动的HPT基因和GUS基因)的EHA105农杆菌菌株对其进行了转化研究,通过GUS瞬时表达检测初步探讨了农杆菌活化、AS、共培养时间等转化的影响因素。实验结果表明:对于广藿香叶片和愈伤组织,以AAM作为农杆菌活化培养基,在活化和共培养时添加AS200μM,共培养4d时GUS瞬时表达率最高,经选择培养后获得抗性芽。