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背景和目的：
血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是已知作用最强的促血管生成因子之一,且研究表明VEGF在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。VEGF基因上存在多个多态性位点,其中VEGF基因启动子区上游-2578C/A和下游+936C/T单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP)已被证明可影响VEGF蛋白表达,且与多种疾病的发生发展相关。本课题通过研究内皮生长因子(VEGF)936*T/C单核苷酸多态性了解该突变位点对VEGF表达的影响及其功能效应。
方法：
采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(Polymerase chainreaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)方法检测不同肝细胞VEGF936T/C基因型,筛选标准模版。以双萤光素酶报告基因检测系统为基础,将含VEGF936*T和C靶基因序列片段的重组质粒转染入293T细胞,利用化学发光仪和荧光定量PCR,检测比较其荧光素酶(Luc)表达活性。同时采用不同肝细胞,在放线菌素D(ActD)的作用下,利用荧光定量PCR检测VEGFmRNA的含量,研究肝细胞VEGF936*T/C单核苷酸多态性对VEGF mRNA稳定性的影响。
结果：
1.酶切电泳及碱基测序结果表明:线性pGL3-promoter与VEGF936T/C链接正确;VEGF936T/C序列符合实验要求,重组质粒pGL3-VEGFC和pGL3-VEGFT构建成功。
2.VEGF936 C等位基因在293T细胞中荧光素酶活性显著高于T等位基因,表达Luc的量是T等位基因的2.035-3.876倍(P＜O.05)。
3.在ActD作用下,含936*C/C基因型的肝细胞中VEGF降解速度较慢(P＜0.05)。
结论：
936 C等位基因可能加强VEGF转录活性,使VEGF mRNA的寿命延长,提高了蛋白质合成的起始速度。