论文部分内容阅读
第一部分叶酸靶向携氧载吲哚菁绿壳核纳米粒的制备及特性检测目的:合成叶酸靶向携氧载吲哚菁绿壳核纳米粒(TOI_HNPs)和单纯的脂质或PLGA纳米粒,探究比较其基本特性。方法:两步骤法联合溶液蒸发法合成TOI_HNPs,乳化法合成携氧载吲哚菁绿PLGA纳米粒(OI_PNPs)及叶酸靶向携氧载吲哚菁绿脂质纳米粒(TOI_LNPs)。观察TOI_HNPs的基本形态,测定纳米粒的粒径、电位、包封率及载药量,并检测在近红外光激发前后TOI_HNPs直径和表面电位的变化。体外比较三种纳米粒的吸收光谱、荧光光谱、稳定性及其释氧能力。结果:成功制备具有壳核结构的TOI_HNPs,光学显微镜下呈大小均一、分散良好的球形,能够被近红外光激发发生相变。TOI_HNPs、OI_PNPs和TOI_LNPs的直径分别为166.83±5.56nm、214.50±10.87nm和340.47±16.06nm,表面电位分别为-30.57±1.36mV、-24.04±1.17mV和-17.50±1.65mV,TOI_HNPs的ICG包封率和载药量分别为72.29±2.92%和1.02±0.04%,OI_PNPs和TOI_LNPs的ICG包封率分别为62.48±3.39%和82.50±2.84%,OI_PNPs和TOI_LNPs的ICG载药量分别为1.84±0.10%和2.20±0.08%。另外,三种纳米粒的吸收光谱及荧光光谱均与游离ICG溶液相似,未见明显的偏移。经过15天的观测,TOI_HNPs、OI_PNPs、TOI_LNPs和游离ICG的紫外吸收值分别下降至原始的75.4%、56.2%、35.4%和12.5%,荧光强度分别下降至原始的62.7%、35.6%、14.8%和4.0%。TOI_HNPs和OI_PNPs的粒径在30天内分别增加至239.40±15.75nm和386.27±11.29nm。而值得注意的是,TOI_LNPs在第5天时粒径明显增大至523.97±58.08nm,第10天时变大到微米级,并且单峰消失。此外,由PBS重悬的TOI_HNPs、OI_PNPs和TOI_LNPs 72小时ICG累积释放量分别为25.95%、30.51%和66.68%;用10%的胎牛血清重悬的TOI_HNPs、OI_PNPs和TOI_LNPs72小时ICG累积释放量分别为29.05%、34.97%和80.59%。最后,经激光加超声处理后,TOI_HNPs溶液内的氧浓度从3.36 mg/L增加到6.85 mg/L。结论:成功制备了靶向携氧载吲哚菁绿壳核纳米粒TOI_HNPs,具有良好的载药、相变及释氧能力,并且其ICG包封率比OI_PNPs高,TOI_HNPs稳定性比TOI_LNPs高,是良好的纳米传送系统。第二部分叶酸靶向携氧载吲哚菁绿壳核纳米粒的成像作用研究目的:探讨TOI_HNPs的双模态成像能力。方法:体外超声及光声成像使用凝胶模型进行研究。将TOI_HNPs溶于脱气水中,按照ICG浓度稀释成1、2、4、6、8、16μg/ml,通过百胜超声诊断仪和光声成像仪观察其在激光照射后的显像能力,并使用DFY软件和光声成像仪自带软件分析超声和光声信号强度。同时比较8μg/ml的TOI_HNPs与同等浓度的游离ICG和TO_HNPs在激光照射前后的成像。体内光声成像使用皮下荷瘤裸鼠,随机分为四组后经尾静脉分别注射生理盐水、游离ICG、OI_PNPs和TOI_HNPs(8μg/ml),在不同时间点(0、0.5、1、2、4、6、8、12h)观察肿瘤局部的光声图像。结果:在体外超声实验中,TOI_HNPs造影剂在ICG为0-8μg/ml浓度内经激光照射后,超声模式(B-模式)及增强造影模式(CEUS)的回声强度(EI)随其浓度的增加而增加,呈线性相关,但在16μg/ml浓度下增势不明显。此外,经激光照射后8μg/ml的TOI_HNPs超声显影比TO_HNPs明显增强,TOI_HNPs的B-模式和CEUS中的EI值分别从8.19±0.91增加到81.88±10.73和从4.87±0.51增加到49.13±0.91。在体外光声成像中,TOI_HNPs在激光照射后的光声信号随着浓度增加而线性增强。另外,8μg/ml的TOI_HNPs经激光照射后的光声成像比TO_HNPs明显增强,PA平均值从0.145±0.016增加到1.526±0.090;而同等浓度下的游离ICG的光声信号反而从0.274±0.015下降至0.060±0.003。在体内光声成像实验中,注射造影剂(ICG、OI_PNPs和TOI_HNPs)的小鼠肿瘤局部光声显像明显增强。在注射TOI_HNPs后2小时达高峰,PA平均值为0.615±0.033;而注射ICG和OI_PNPs的裸鼠肿瘤在6小时后才达高峰,PA平均值分别为0.380±0.014和0.529±0.017。结论:TOI_HNPs可作为一种超声/光声成像的双模态造影剂,增强超声及光声信号。并且TOI_HNPs比OI_PNPs具有更好的肿瘤靶向性,光声成像的灵敏度更高。第三部分叶酸靶向携氧载吲哚菁绿壳核纳米粒的治疗作用研究目的:探讨光声动力介导TOI_HNPs对SKOV3癌细胞的杀伤作用及机制。方法:通过MTT法测定不同浓度TOI_HNPs的生物安全性,通过共聚焦显微镜和流式细胞术观察TOI_HNPs的体外寻靶能力。将实验分为6组:对照组、ICG+PSDT、TO_HNPs+PSDT、TI_HNPs+PSDT、OI_HNPs+PSDT、TOI_HNPs+PSDT。通过MTT法测定SKOV3细胞存活率和流式细胞术评估细胞凋亡率。通过荧光酶标仪测定细胞内ROS及无细胞体系SOSG的荧光增加量,并通过蛋白印迹检测缺氧诱导因子1-α(HIF-1α)和IL-6的表达。结果:TOI_HNPs在0-8μg/ml内对SKOV3细胞无明显毒性,故选用8μg/ml进行实验。TOI_HNPs能够通过叶酸及叶酸受体连接的方式主动靶向SKOV3细胞。ICG及TO_HNPs联合光声动力组对癌细胞无明显杀伤作用,TOI_HNPs+PSDT、OI_PNPs+PSDT及TI_HNPs+PSDT组的细胞存活率分别为16.39±2.58%、41.58±2.10%和53.85±4.58%,凋亡率分别为81.58±7.68%、52.04±14.66%和43.26±11.10%。TOI_HNPs+PSDT组细胞内ROS增加量为244.27±29.11%,明显高于其他各组(P<0.05),TOI_HNPs+PSDT组和OI_PNPs+PSDT组体外SOSG的荧光增加量分别为203.87±9.74%和189.23±14.05%,两组之间无统计学意义,但相比对照组具有统计学意义(P<0.05)。此外,相比其他各组,TOI_HNPs+PSDT组能够显著下调HIF-1α和IL-6蛋白的表达(P<0.05)。结论:TOI_HNPs能够主动靶向SKOV3细胞,并可联合光声动力增加细胞内的ROS产生、下调HIF-1α和IL-6蛋白的表达,增强对癌细胞的杀伤作用。